用于鑒定肝損傷的生物標記的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求于2012年10月24日提交的美國臨時申請?zhí)?1/717,977的優(yōu)先權， 其整個公開內容通過引用結合在本文中。
技術領域
[0003] 現(xiàn)在公開的本發(fā)明一般地涉及免疫分析物作為用于鑒定哺乳動物中的肝損傷和/ 或預測患有肝損傷的哺乳動物的存活性的生物標記的應用。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 由藥物和化學劑引起的肝損傷是流行性和重要性持續(xù)增加的問題。在美國，藥物 誘發(fā)的肝損傷（drug induced liver injury，DILI)是急性肝衰竭的常見原因，其占此類病 例的約13% (1-3)。DILI還是導致另外有希望的新藥候選物的放棄或導致新藥經常僅在使 用幾個月后就從市場上召回的最常見的不利藥物事件。此類事件不僅在發(fā)展DILI的人所 經歷的疼痛、折磨和死亡方面具有明顯和主要的人類代價，并且對已經開發(fā)了這些藥物的 公司、對他們的股東以及對整個社會也具有重大的經濟代價，因為用于開發(fā)此類遭惡運的 藥物的資源本可以更好地花費在其他措施上以改善我們的健康和福利（4-7)。
[0006] DILI的流行性混雜著草藥藥物和膳食補充劑（HDS)的日益增長的使用。由于它們 是"天然的"，因此這些通常被認為是安全的。然而，清楚的是，這些中的很多都可能引起嚴 重的肝損傷。近年來，在美國，約10%的DILI病例已經涉及HDS (10)，在遠東甚至報道了更 高的頻率（11)。
[0007] 除了 DILI之外，哺乳動物的肝臟可能以多種其他方式受損，包括由于病毒感染引 起的炎癥（例如，甲型、乙型、丙型或戊型肝炎），膽管堵塞，膽固醇或甘油三酯累積，和流向 肝臟的血液流動受損。
[0008] 不管其病因學，肝損傷可能難以診斷。對于肝損傷常用的生物標記，如血清氨基轉 移酶、堿性磷酸酶和其他酶，具有有限的靈敏性和特異性（7, 9)。此外，提供肝損傷的準確的 預后甚至要更困難。對于患有急性肝衰竭的患者，沒有可靠的檢測能夠預測近期內（例如， 六個月的時間期間）是否有必要進行肝移植。由于移植手術的有限的肝臟供應，因此，區(qū)分 近期內需要移植的患者與近期內不需要移植的患者是至關重要的。
[0009] 因此，亟需用于準確檢測肝損傷并且預測患有威脅生命的肝損傷的受試者在給定 時間期間內的存活性的方法和試劑盒。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明提供表征個體，如哺乳動物（例如，人）中的肝損傷的方法。例如，所述方 法可以用于區(qū)分經歷威脅生命的肝損傷的個體與經歷不威脅生命的肝損傷的個體。所述方 法還可以用于監(jiān)測有肝損傷危險（例如，由于DILI、病毒性肝炎、自體免疫性肝炎、缺血性 肝炎等）的個體，并且確定該個體是否可能經歷威脅生命的肝衰竭和在特定的時間期間內 是否需要肝移植。本發(fā)明特別是基于免疫學標記（即，免疫分析物和血清白蛋白）的成功 鑒定，所述免疫學標記在其血液濃度水平上表現(xiàn)出與增加的威脅生命的肝損傷的危險相關 的協(xié)調變化。
[0012] 因此，在一方面，本發(fā)明提供表征個體中的肝損傷的方法。在某些實施方案中，所 述方法包括直接或間接獲得來自個體的血液樣品中的血清白蛋白的濃度。然后，將得到的 血清白蛋白的濃度與預先確定的血清白蛋白的濃度（例如，3. 5g/dL，3. 2g/dL或2. 8g/dL) 進行比較。在某些實施方案中，所述方法包括直接或間接獲得來自個體的血液樣品中一 種或多種免疫分析物的濃度，所述免疫分析物選自由以下組成的組：TNFa，IL-12, IL-17， IL-4, IL-5, IL-13, IL-9，MIP-1 0，RANTES，F(xiàn)GF b，PDGF-bb 和 IL-6。然后，將這樣得到的一 種或多種免疫分析物的濃度與在健康個體（例如，具有健康的肝臟的個體）的血液中發(fā)現(xiàn) 的該免疫分析物的濃度相比較。在某些實施方案中，如果（1)所述個體的血清白蛋白濃度 小于或等于預先確定的血清白蛋白的濃度（例如，2. 8g/dL)，并且（2)所述個體血液中所述 一種或多種免疫分析物的濃度小于健康個體血液中相對應的免疫分析物的中值濃度（然 而，對于IL-6,適用的條件是個體血液中的濃度大于健康個體血液中IL-6的中值濃度），則 所述個體被鑒定為具有威脅生命的肝損傷。在某些實施方案中，如果所述個體血清白蛋白 的濃度大于預先確定的血清白蛋白的濃度（例如，2. 8g/dL)，和/或所述個體血液中至少一 個得到的免疫分析物濃度不小于健康個體血液中相對應的免疫分析物的中值濃度（然而， 對于IL-6,適用的條件是個體血液中的濃度不大于健康個體血液中IL-6的中值濃度），則 所述個體被鑒定為具有不威脅生命的肝損傷。
[0013] 在某些實施方案中，所述方法進一步包括通知所述個體其已經被鑒定具有威脅生 命的肝損傷。在其他實施方案中，所述方法還包括通知所述個體其已經被鑒定為具有不威 脅生命的肝損傷。在某些實施方案中，所述方法進一步包括為所述個體提供與所述個體的 鑒定狀態(tài)（即，具有威脅生命的或不威脅生命的肝損傷）相一致的醫(yī)學護理。例如，在某些 實施方案中，所述方法還包括：如果所述個體被鑒定具有威脅生命的肝損傷，則對所述個體 開皮質類固醇（例如，潑尼松（prednisone))的步驟。在其他實施方案中，所述方法還包括 如果所述個體被鑒定具有威脅生命的肝損傷，則對所述個體推薦肝移植程序的步驟。在某 些實施方案中，所述方法還包括如果所述個體被鑒定具有威脅生命的肝損傷，則對所述個 體進行肝移植的步驟。
[0014] 本發(fā)明的方法中所用的血液樣品可以是血清樣品。備選地，所述血液樣品可以是 血漿樣品。通常，應該將為所述個體確定的免疫分析物的濃度與由相同類型的樣品確定的 濃度（例如，中值濃度）進行比較（例如，個體血清中的IL-17濃度應該與在來自健康個體 的血清樣品中檢測到的IL-17的中值濃度進行比較）。在優(yōu)選的實施方案中，所述個體是哺 乳動物，如人。
[0015] 在優(yōu)選的實施方案中，直接或間接獲得一種或多種免疫分析物的濃度包括獲得選 自由以下組成的組的至少三種、更優(yōu)選四種免疫分析物的濃度：TNF a，IL-12, IL-17, IL-4， IL-5, IL-13, IL-9, MIP-1 0，RANTES，F(xiàn)GF b，PDGF-bb 和 IL-6。優(yōu)選地，所述方法包括獲得 IL-17、RANTES和/或H)GF bb的濃度。優(yōu)選地，所述方法包括獲得IL-17、RANTES和/或 TOGF bb的濃度，和獲得選自由IL-4、IL-13、IL-9和FGF b組成的組的至少一種另外的免 疫分析物的濃度。在某些實施方案中，所述方法包括獲得IL_17、RANTES和/或TOGF bb以 及TNF a和FGF b二者的濃度。任意前述方法可以進一步包括獲得來自個體的血液樣品中 的IL-6的濃度。如本文其他地方所討論的，大于健康個體中的IL-6中值濃度的IL-6濃度 與具有威脅生命的肝損傷的個體相一致。
[0016] 在相關方面中，本發(fā)明提供評估臨床試驗所招募的受試者中的肝損傷的方法。所 述方法可以以上文和本文其他地方所述的表征個體中肝損傷的方法的方式進行。然而，在 某些實施方案中，所述評估臨床試驗所招募的受試者中的肝損傷的方法包括鑒定所述受試 者為具有威脅生命的肝損傷、不危險生命的肝損傷或正常的肝功能的步驟。威脅生命的肝 損傷和不威脅生命的肝損傷如上文和本文其他地方所述進行鑒定。例如，如果（i)從所述 受試者血液樣品得到的血清白蛋白濃度值大于預先確定的血清白蛋白濃度（例如，2. 8g/ dL，3.2g/dL，或3.5g/dL)，并且（ii)由受試者血液樣品得到的所述一種或多種免疫分析物 的濃度全部大于或等于健康受試者中血液中相對應的免疫分析物的中值濃度（然而，對于 IL-6,適用條件是個體血液中的濃度小于或等于健康個體血液中IL-6的中值濃度），可以 鑒定正常的肝功能。
[0017] 在某些實施方案中，所述受試者是哺乳動物，如人。在某些實施方案中，所述臨床 試驗是用于新藥（例如，抗癌藥或抗炎藥）。在某些實施方案中，所述受試者有DILI的危 險。
[0018] 在另一方面中，本發(fā)明提供評估患有肝損傷的個體的存活性的方法。典型地，所述 個體是哺乳動物，如人。在某些實施方案中，所述方法包括直接或間接獲得來自所述個體的 血液樣品（例如，血清樣品）中血清白蛋白的濃度。在某些實施方案中，所述方法包括直 接或間接獲得來自所述個體的血液樣品（例如，血清樣品）中一種或多種免疫分析物的濃 度，所述免疫分析物選自由以下組成的組：TNFa，IL-12, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13, IL-9， MIP-10，RANTES，F(xiàn)GF b，H)GF-bb和IL-6。在獲得目的免疫分析物的濃度后，在個體基礎上， 將所述值與在健康個體（例如，具有健康的肝臟的個體）血液中發(fā)現(xiàn)的相對應的免疫分析 物的中值濃度進行比較。按照本發(fā)明的某些實施方案，所述方法包括確定由患者血液樣品 獲得的一種或多種免疫分析物的濃度是否小于健康個體的所述免疫分析物的中值濃度的 步驟（然而，對于IL-6,適用的條件是個體血液中的濃度大于健康個體血液中IL-6的中值 濃度）。除了比較目的免疫分析物的測量值之外，由個體血液樣品獲得的血清白蛋白的濃度 還與預先確定的濃度范圍或截點值（例如，2-5g/dL，2-4g/dL，2-3g/dL，2. 5-3g/dL或2. 8g/ dL)進行比較，并且確定所述個體的血清白蛋白濃度是（i)小于所述濃度范圍（或小于或等 于預先確定的截點值），還是（ii)在所述濃度范圍之內（或大于預先確定的截點值）。
[0019] 在某些實施方案中，所述方法包括鑒定個體具有從肝損傷存活的高可能性（例 如，有90%以上的機會再活六個月）或死于肝損傷的高可能性（例如，有90%以上的機會 在接下來的六個月內死亡，除非進行肝移植）的步驟?？梢曰跍y量的免疫分析物濃度和 血清白蛋白濃度的分析和比較完成所述鑒定。例如，當所述樣品的測量的血清白蛋白濃度 值大于預先確定的截點值（例如，2. 8g/dL)時或當從所述個體得到的一種或多種免疫分析 物的濃度中的任一種大于或等于在健康個體血液中發(fā)現(xiàn)的相對應的免疫分析物的中值濃 度時（然而，對于IL-6,適用條件是個體血液中的濃度小于或等于健康個體血液中IL-6的 中值濃度），所述個體可以被鑒定具有從肝損傷存活的高可能性。相反地，當從所述個體得 到的血清白蛋白濃度小于或等于預先確定的截點值（例如，2. 8g/dL)時和當從所述個體 得到的一種或多種免疫分析物的濃度全部小于在健康個體血液中發(fā)現(xiàn)的相對應的免疫分 析物的中值濃度時（然而，對于IL-6,適用條件是個體血液中的濃度大于健康個體血液中 IL-6的中值濃度），所述個體可以被鑒定為具有死于肝損傷的高可能性。
[0020] 在另一方面中，本發(fā)明提供以接受肝移植的順序對多名患者（包括第一名患者和 第二名患者）進行優(yōu)先排序的方法。在這一點上，更迫切需要肝移植的患者可以相對于可 能完全不需要肝移植（或至少肝移植的需要不那么迫切）的患者優(yōu)先排序。按照本發(fā)明 的某些實施方案，各自的血液樣品是從多名患有（或相信患有）肝損傷的個體收到的。對 于每份樣品，獲得血清白蛋白的濃度值（例如，通過適當的測定測量），并且獲得（例如，測 定）一種或多種免疫分析物各自的濃度值，所述免疫分析物選自由以下組成的組：TNF a， IL-12, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13, IL-9, MIP-1 0，RANTES，F(xiàn)GF b，PDGF-bb 和 IL-6。
[0021 ]由第一名個體得到的免疫分析物濃度可以與在健康個體血液中發(fā)現(xiàn)的相對應的 免疫分析物的中值濃度進行比較，以確定所述個體的一種或多種免疫分析物的濃度中的 任一種是否小于在健康個體血液中發(fā)現(xiàn)的相對應的免疫分析物的中值濃度（然而，對于 IL-6,適用條件是所述個體血液中的濃度大于在健康個體血液中的IL-6的中值濃度）。類 似地，將從第二名個體得到的免疫分析物濃度與在健康個體血液中發(fā)現(xiàn)的相對應的免疫分 析物的中值濃度進行比較，以確定所述個體的一種或多種免疫分析物的濃度中的任一種是 否小于在健康個體血液中發(fā)現(xiàn)的相對應的免疫分析物的中值濃度（同樣地，對于IL-6,適 用條件是所述個體血液中的濃度大于在健康個體血液中的IL-6的中值濃度）。
[0022] 在某些實施方案中，所述方法包括確定下述中的一個的步驟：（i)第一個體樣品 具有大于預先確定范圍或截點值（例如，2. 8g/dL)的血清白蛋白濃度值，或（ii)第一個體 樣品的一種或多種免疫分析物的濃度中的任一種大于或等于健康個體血液中相對應的免 疫分析物的中值濃度（然而，對于IL-6,適用條件是所述個體血液中的濃度小于或等于在 健康個體血液中的IL-6的中值濃度）。在某些實施方案中，所述方法包括確定下述中的一 個的步驟：（i)第二個體樣品具有小于預先確定范圍（例如，2. 5-3. Og/dL)或小于或等于預 先確定的截點值（例如，2. 8g/dL)的血清白蛋白濃度值，（ii)第二個體樣品的一種或多種 免疫分析物的濃度全部小于健康個體血液中相對應的免疫分析物的中值濃度（然而，對于 IL-6,適用條件是所述個體血液中的濃度大于在健康個體血液中的IL-6的中值濃度）。按 照本發(fā)明的某些實施方案，可以進行鑒定第二個體具有比第一個體更高的由肝損傷致死的 危險的步驟。因此，在某些實施方案中，可以進行另外的步驟，提供應該在對第一個體進行 肝移植之前對第二個體進行肝移植的推薦。在這一點上，第二個體優(yōu)先第一個體排序接受 肝移植。
[0023] 在另一方面中，本發(fā)明提供可以用于實施本發(fā)明的方法的試劑盒。在某些實施 方案中，所述試劑盒可以包括：a)第一抗體，所述第一抗體適于檢測并定量血清白蛋白和 /或選自由以下組成的組的免疫分析物：TNFa，IL-12, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13, IL-9， MIP-1，RANTES，F(xiàn)GFb，H)GF-bb和IL-6 ; (ii)使用說明，所述使用說明關于基于免疫分析物 和血清白蛋白的濃度分別與代表具有健康肝臟的個體的相對應的免疫分析物的中值濃度 和預先確定的血清白蛋白的范圍（例如，2. 5-3. Og/dL)或截點值（例如，2. 8gL)的比較來 表征肝損傷。在某些實施方案中，所述使用說明還包括列出具有健康肝臟的個體中的免疫 分析物（例如，TNFa，IL-12, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13, IL-9, MIP-10，RANTES，F(xiàn)GF b， H)GF-bb，IL-6)的中值濃度的表格。
[0024] 在某些實施方案中，所述試劑盒還包括第二抗體，所述第二抗體適于檢測血清白 蛋白和/或選自由以下組成的組的免疫分析物：TNFa，IL-12, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13， IL-9，MIP-10，RANTES，F(xiàn)GF b，H)GF-bb和IL-6。在某些實施方案中，所述第二抗體與所述 第一抗體結合相同的免疫分析物，但是結合不同的表位。在其他實施方案中，所述第二抗體 與所述第一抗體結合不同的免疫分析物。
[0025] 在某些實施方案中，所述試劑盒還包括第二抗體和第三抗體，各自適合檢測血清 白蛋白和/或選自由以下組成的組的免疫分析物：TNF a，IL-12, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13， IL-9，MIP-10，RANTES，F(xiàn)GF b，H)GF-bb和IL-6。在某些實施方案中，第三抗體與所述第一 或第二抗體結合相同的免疫分析物，但是結合不同的表位。在其他實施方案中，所述第三抗 體與所述第一和第二抗體結合不同的免疫分析物。
[0026] 在某些實施方案中，所述試劑盒還包括第二抗體、第三抗體和第四抗體，各自適于 檢測血清白蛋白和/或選自由以下組成的組的免疫分析物：TNFa，IL-12, IL-17, IL-4， 11-5，11-13，11-9，]\〇?-10，狀階^5，？6?13，？〇6?-此和11-6。在某些實施方案中，所述第四 抗體與所述第一抗體、第二抗體或第三抗體結合相同的免疫分析物，但是結合不同的表位。 在其他實施方案中，所述第四抗體與所述第一、第二和第三抗體結合不同的免疫分析物。
[0027] 在某些實施方案中，所述試劑盒的第一抗體結合選自由IL-9, IL-17, RANTES和 roGF-bb組成的組的免疫分析物。在某些實施方案中，所述試劑盒的第一和第二抗體結合選 自由IL-9, IL-17, RANTES和roGF-bb組成的組的免疫分析物。在某些實施方案中，所述試 劑盒的第一、第二和第三抗體結合選自由IL-9, IL-17, RANTES和H)GF-bb組成的組的免疫 分析物。在某些實施方案中，所述試劑盒的第一、第二、第三和第四抗體結合選自由IL-9， IL-17, RANTES和PDGF-bb組成的組的免疫分析物。
[0028] 在某些實施方案中，至少一種抗體（例如，第一、第二、第三或第四抗體）連接在 固體支持物上。在某些實施方案中，所有這些抗體都連接在固體支持物上。所述固體支持 物可以提供多路測定，諸如將適用于檢測和定量血清白蛋白和/或選自由以下組成的組的 免疫分析物（例如，三種或四種分析物）：TNFa，IL-12, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13, IL-9， MIP-10，RANTES，F(xiàn)GF b，H)GF-bb和IL-6。在某些實施方案中，所述多路測定檢測并定量 IL-9、IL-17、RANTES 和 PDGF-bb 中的每一種。
[0029] 附圖簡述
[0030] 已經在整體上這樣描述了本發(fā)明的實施方案，現(xiàn)在將參考附圖，所述附圖沒必要 按照比例，并且其中：
[0031] 圖1示例本發(fā)明某些實施方案所述的方法；
[0032] 圖2示例本發(fā)明某些實施方案所述的一種具體的方法；
[0033] 圖3示例簡化的免疫應答模型；
[0034] 圖4顯示示例具體研宄團體的流程圖；
[0035] 圖5示例DILI發(fā)作時血清中免疫分析物的分布；
[0036] 圖6示例在6個月的隨訪時DILI受試者血清中的細胞因子的分布；
[0037] 圖7示例在DILI發(fā)作時DILI受試者血清中趨化因子的分布。
[0038] 發(fā)明詳述
[0039]現(xiàn)在將參考附圖在下文中更充分地描述本發(fā)明，在所述附圖中顯示了本發(fā)明的一 些實施方案而不是全部的實施方案。事實上，本發(fā)明可以以多種不同的形式實施，并且不應 該解釋為限于其中所述的實施方案；相反，提供這些實施方案，以使本公開內容滿足適用的 法律要求。當在本說明書中和附上的權利要求書中時，單數形式"一個（'a'，'an'）"和 "所述（'the'）"包括復數對象，除非上下文明確另外指示。
[0040] 以其最概括的形式，本發(fā)明涉及表征個體中的肝損傷的方法。肝損傷的起源可以 是，例如，病毒性肝炎，缺血性肝炎，自體免疫性肝炎，DILI，或引起肝衰竭的代謝疾病。因 此，在某些實施方案中，肝損傷的起源是DILI。然而，在所述方法的一些應用中，肝損傷的 起源是未知的。肝損傷可以是威脅生命的肝損傷，或是不威脅生命的肝損傷。當用于本文 時，術語"威