一種基于固相酶聯(lián)免疫熒光斑點(diǎn)的肝癌轉(zhuǎn)移診斷試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫學(xué)及腫瘤診斷技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于固相酶聯(lián)免疫熒光斑 點(diǎn)的肝癌腫瘤細(xì)胞捕獲及診斷試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝癌主要是肝細(xì)胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界上最常見 的惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，發(fā)病率仍持續(xù)升高。目前已成為我國 第二位癌癥死亡原因。盡管近幾十年以來在肝癌診治和基礎(chǔ)研宄方面均取得了長足的進(jìn) 步，但總體而言，肝癌的預(yù)后并沒有得到顯著的改善，5年生存率僅為5%左右。手術(shù)切除仍 是最主要的治療方法，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)己成為阻礙肝癌患者長期生存的關(guān)鍵。因此，臨床上迫切需 要探索肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的相關(guān)預(yù)測指標(biāo)來優(yōu)化治療方案。對病人預(yù)后的準(zhǔn)確評估可對高危轉(zhuǎn) 移復(fù)發(fā)病人增強(qiáng)輔助治療或采用侵襲性較小的治療方案，對低危轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)病人避免過度治 療，從而使實(shí)現(xiàn)治療個(gè)體化，提高病人的生活質(zhì)量。
[0003] 傳統(tǒng)意義上的預(yù)后預(yù)測指標(biāo)為腫瘤的臨床病理分期和腫瘤細(xì)胞分化分級，該分期 和分級能大致反映不同病人術(shù)后生存率的差別。但這些臨床病理特征并不能準(zhǔn)確預(yù)測轉(zhuǎn)移 復(fù)發(fā)和病人預(yù)后。惡性腫瘤都會(huì)通過血液傳播轉(zhuǎn)移到身體的其他器官，而腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致 腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤細(xì)胞侵入到原發(fā)腫瘤細(xì)胞的周圍組織中，進(jìn)入血液和淋巴 管系統(tǒng)，形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC，circulatingtumorcell)，并轉(zhuǎn)運(yùn)到遠(yuǎn)端組織，再滲出， 適應(yīng)新的微環(huán)境，最終"播種"、"增殖"、"定植"、形成轉(zhuǎn)移灶。因此早期發(fā)現(xiàn)血液中的肝癌 CTC，可提供更多信息，有望準(zhǔn)確預(yù)測肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，對于患者預(yù)后判斷、療效評價(jià)和個(gè)體 化治療都有著重要的指導(dǎo)作用。
[0004] 外周血樣本由于其獲取技術(shù)簡單、創(chuàng)傷小、便于在同一患者多次重復(fù)進(jìn)行，易于被 患者接受，對于預(yù)測轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的可能性更為重要。尤其是針對易于血道轉(zhuǎn)移的腫瘤，利用外 周血標(biāo)本檢測其中是否存在具有轉(zhuǎn)移傾向的腫瘤細(xì)胞，臨床意義更大。目前，已經(jīng)開發(fā)的外 周血中癌細(xì)胞特異性標(biāo)記物，如AFP，MAGE、CK19基因，以及外周血游離DNA檢測等已被初步 用于轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的預(yù)測。然而，上述標(biāo)志物既可能來源于原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞，也可能來源于循環(huán) 中的腫瘤細(xì)胞，因此，該標(biāo)志物表達(dá)水平的高低并不能準(zhǔn)確反映直接影響腫瘤轉(zhuǎn)移的循環(huán) 腫瘤細(xì)胞的情況。因此，尋找能夠直接捕獲到外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法己成為近年來研 宄的熱點(diǎn)。
[0005]目前現(xiàn)存的幾種循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲技術(shù)主要包括：（1)基于流式熒光技術(shù)、免疫 磁珠分離技術(shù)針對CTC細(xì)胞膜上特異性蛋白開發(fā)的CellSearch試劑盒；（2)利用腫瘤細(xì) 胞體積較其他血細(xì)胞大的特性開發(fā)的ISET法（Isolationbysizeofepithelialtumor cells) ; (3)其他，如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)、免疫細(xì)胞化學(xué)法等。但是這些CTCs檢測技術(shù) 均存在其局限性與不足，從而局限了其應(yīng)用。（l)CellSearch試劑盒的缺點(diǎn)是：操作復(fù) 雜，費(fèi)用高，計(jì)數(shù)效果低，能否從血液中檢測到腫瘤細(xì)胞很大程度上依賴于可分析的細(xì)胞數(shù) 量。（2)ISET法的缺點(diǎn)是：不適用于體積較小的細(xì)胞，體積小的CTCs有漏檢可能，造成假陰 性。同時(shí)也不適用于具有異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞檢測。（3)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)技術(shù)的缺點(diǎn)是：假陽性率較高，由于基因的非法轉(zhuǎn)錄和活性假基因，正常粒細(xì)胞可表達(dá)部分細(xì)胞角蛋白如 CKZO、CK19;細(xì)胞形態(tài)學(xué)被破壞，無法進(jìn)一步判斷和進(jìn)行腫瘤細(xì)胞基因和轉(zhuǎn)錄組變化；需要 更嚴(yán)格的標(biāo)本保存條件和實(shí)驗(yàn)條件。（4)免疫細(xì)胞化學(xué)法的缺點(diǎn)是：易造成靶細(xì)胞的丟失， 檢測靈敏性差。更重要的是，上述方法都是基于腫瘤細(xì)胞的表型特征，而不是基于其功能特 征，因此不能保證檢測到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的功能狀態(tài)（無法辨別"活細(xì)胞"和"死細(xì)胞"）。 考慮到有功能的循環(huán)腫瘤細(xì)胞才是造成腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的罪魁禍?zhǔn)?，因此，開發(fā)一種新的用 于功能性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于為克服已有技術(shù)的不足，提供靈敏度高、特異性強(qiáng)的免疫學(xué)原 理作為檢測反應(yīng)，組成ELISP0T肝癌診斷試劑盒，用于檢測外周血中具有AFP及EpCAM分泌 功能的循環(huán)肝癌細(xì)胞，提高肝癌檢測的靈敏度和特異性，輔助肝癌轉(zhuǎn)移的診斷和鑒別診斷。
[0007] 本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] -種基于固相酶聯(lián)免疫熒光斑點(diǎn)的肝癌診斷試劑盒，包括96孔濾膜板、捕獲抗 體、熒光標(biāo)記的檢測抗體、二抗、熒光防淬滅劑、CD45+磁珠及分選器、牛血清白蛋白（BSA)。
[0009] 所述的捕獲抗體為兔抗人AFP和EpCAM捕獲抗體。
[0010] 所述的熒光標(biāo)記的檢測抗體為FITC標(biāo)記的AFP捕獲抗體檢測抗體和Biotin標(biāo)記 的EpCAM捕獲抗體檢測抗體。
[0011] 所述的二抗為抗-FITC-490及SA-550抗體。
[0012] 本發(fā)明所述的肝癌診斷試劑盒具體操作步驟如下：
[0013] 1)捕獲抗體預(yù)包被
[0014] 96孔板中加入1 : 60稀釋的AFP及EpCAM抗體100y1/孔，加蓋37°C孵育l_2h 或4°C過夜，棄包被液，用無菌的磷酸鹽緩沖液洗板，每孔加200y1含牛血清白蛋白的PBS， 加蓋，37°C孵育l-2h，棄上清液，將板直接用于檢測；
[0015] 2)采集血液樣本，并分離得到含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞群；
[0016] 3)檢測
[0017] 包被的96孔板中，待檢測孔加100y1細(xì)胞懸液，陰性對照孔加100y1 1640培養(yǎng) 液，陽性對照孔加100y1含1x104/ml的肝癌細(xì)胞株IfepG2 ;
[0018] 4)將96孔板放入濕潤的培養(yǎng)箱在37°C、5%C02培養(yǎng)18-24h，棄上清液，用含 0? 1 %Tween的PBS洗板；
[0019] 5)每個(gè)孔中加入100y1用1 %BSA的PBS稀釋的熒光素標(biāo)記AFP及EpCAM檢測 抗體，置37°C孵育1-2小時(shí)；
[0020] 6)孵育后用PBS洗板后甩干，加入100y1用PBS1 : 1000倍稀釋的二抗，置37°C 孵育2小時(shí)；
[0021] 7)每孔加入50y1熒光防淬滅劑，放置于室溫閉光顯色；
[0022] 8)棄去熒光淬滅劑，將96孔濾膜板自然晾干；
[0023] 9)使用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)每個(gè)反應(yīng)空孔中熒光斑點(diǎn)，判斷結(jié)果。
[0024] 本發(fā)明結(jié)果的判斷方法為如果能檢測到AFP和EpCAM雙陽性的細(xì)胞即判定為陽 性；如果檢測不到AFP和EpCAM雙陽性的細(xì)胞則判定為陰性。
[0025] 本發(fā)明的有益效果為：克服了已有技術(shù)的不足，提供了靈敏度高、特異性強(qiáng)的免疫 學(xué)原理作為檢測反應(yīng)，組成ELISP0T肝癌診斷試劑盒，用于檢測外周血中表達(dá)AFP及EpCAM 的循環(huán)肝癌細(xì)胞，提高肝癌檢測的靈敏度和特異性，輔助肝癌的診斷和鑒別診斷。
【附圖說明】
[0026] 圖1是種入不同濃度HepG2細(xì)胞后熒光顯微鏡觀測圖像；
[0027] 圖2是熒光顯微鏡下肝癌伴肺轉(zhuǎn)移患者標(biāo)本的細(xì)胞觀測圖像。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以下實(shí)施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 大部分肝癌細(xì)胞株IfepG2都能夠分泌AFP和EpCAM，因此是作為陽性對照的最佳選 擇。我們將體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株H印G2稀釋不同濃度（每孔4X105, 2X105及1X10 5個(gè) 細(xì)胞），應(yīng)用本發(fā)明固相酶聯(lián)免疫熒光斑點(diǎn)的肝癌診斷試劑盒首先對試劑盒進(jìn)行方法學(xué)的 測試：
[0031]( -）捕獲抗體預(yù)包被：
[0032] (1) 96孔板中預(yù)鋪1 : 60稀釋的AFP及EpCAM抗體（捕獲抗體）100y1/孔，加蓋 37°C孵育l_2h或4°C過夜；
[0033] (2)棄包被液，用無菌的磷酸鹽緩沖液（PBS)洗板3次，3min/次；
[0034] (3)每孔加200yl含牛血清白蛋白的PBS，加蓋，37°C孵育l-2h;
[0035] (4)棄上清液，將板直接用于檢測；或放于密封袋中，置4°C保存，1周內(nèi)使用； [0036](二）循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測：
[0037](1)在包被的96孔板中加入：
[0038] a.待檢測孔：100y1不同細(xì)胞密度IfepG2細(xì)胞懸液（每孔4X105,2X10llX105 個(gè)細(xì)胞）；
[0039]b.陰性對照孔：100y1 1640培養(yǎng)液；
[0040] (2)將96孔板放入濕潤的培養(yǎng)箱在37°C、5%C02培養(yǎng)24小時(shí)；
[0041] (3)將96孔板取出，棄培養(yǎng)上清液，用含0? 1 %Tween的PBS洗板4次，3min/次；
[0042] (4)每個(gè)孔中加入100y1用1 %BSA的PBS稀釋的熒光素標(biāo)記AFP及EpCAM檢測 抗體，置37°C孵育1-2小時(shí)；
[0043] (5)孵育后用PBS洗3次，3min/次，洗板后甩干，加入100y1用PBS1 : 1000倍 稀釋的抗-FITC-490及SA-550抗體（二抗），置37°C孵育2小時(shí)；
[0044] (6)每孔加入50y1熒光防淬滅劑，放置于室溫閉光顯色；
[0045] (7)棄去熒光淬滅劑，將96孔濾膜板自然晾干。
[0046](四）結(jié)果觀察：
[0047] 使用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)每個(gè)反應(yīng)空孔中紅綠熒光斑點(diǎn)，每一個(gè)綠色熒光點(diǎn)代表一個(gè) 分泌AFP的細(xì)胞；每一個(gè)紅色熒光點(diǎn)代表一個(gè)分泌EpCAM的細(xì)胞。其中，熒光顯微鏡對于紅 綠熒光激發(fā)光波長分別為：綠色熒光FITC(激發(fā)光波長490nm/發(fā)射光波長510nm)，紅色熒 光Cy3 (激發(fā)光波長550nm/發(fā)射光波長570nm)。
[0048] 種入不同濃度11印62細(xì)胞（每孔4\105,2\10 5及1\105個(gè)細(xì)胞）后，使用熒光 顯微鏡下檢測AFP(綠色）及EpCAM陽性（紅色）細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果如圖1所示，加入不同濃 度的HepG2細(xì)胞后，本試劑盒所檢測到的陽性細(xì)胞數(shù)也呈現(xiàn)出明顯的數(shù)量梯度。上述結(jié)果 說明，本試劑盒能夠較好地反映樣本中的肝癌細(xì)胞數(shù)量。
[0049] 實(shí)施例2
[0050] 進(jìn)一步利用肝癌轉(zhuǎn)移的患者（陽性組）及健康成人（陰性組）的外周血標(biāo)本，對 本試劑盒進(jìn)行方法學(xué)的測試。入選的患者信息：王某，男，54歲，診斷為"原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌 伴肺轉(zhuǎn)移"，于2014年4月22日在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科住院治療。陰性組 為在我院門診行健康體檢的志愿者，作為正常對照。
[0051] 應(yīng)用本發(fā)明固相酶聯(lián)免疫熒光斑點(diǎn)的肝癌診斷試劑盒進(jìn)行診斷：
[0052](一）含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞群初分離：
[0053] (1)取4_5ml血液加入含肝素鈉或擰檬酸鈉的采血管，按抗凝劑：血液樣本體積比 1 : 9使用3. 8 %枸櫞酸鈉溶液抗凝；
[0054] (2)將含抗凝血的采血管顛倒混勻5次以上避免血液分層，按1 : 1-1 : 3的比例 將抗凝血加入含淋巴細(xì)胞分層液的無菌離心管中，形成明顯界面，在室溫下2000-3000rpm 離心 20_30m