in;
[0055] (3)可見(jiàn)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)存在于云霧狀層中，用無(wú)菌滴管吸取至新的干 凈離心管中；
[0056] (4)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CD45負(fù)分選的方法，在樣本準(zhǔn)備階段過(guò)濾掉白細(xì)胞以排除白細(xì)胞 對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響（注：CD45在所有白細(xì)胞上都有表達(dá)，稱為白細(xì)胞共同抗原）。向上述外 周單個(gè)核細(xì)胞混合液中加入BeadsBuffer中重懸，加入humanCD45MicroBeadsreagent， 輕柔混勾室溫孵化45min，使用magneticseparationcolumns去除⑶45+細(xì)胞，收集流出 的CD45-細(xì)胞；
[0057] (5)加入400yl預(yù)熱至37°C的含10X小牛血清的1640培養(yǎng)液重懸沉淀細(xì)胞，取 10y1細(xì)胞懸液加入40pl臺(tái)酚藍(lán)，取10y1臺(tái)酚藍(lán)混合細(xì)胞液加入血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下 計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)每ml懸液細(xì)胞數(shù)量，用預(yù)熱至37°C的含10X小牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞 懸液至（1-2)X105細(xì)胞/ml;
[0058](二）捕獲抗體預(yù)包被：
[0059] (1) 96孔板中加入1 : 60稀釋的AFP及EpCAM抗體（捕獲抗體）100y1/孔，加蓋 37°C孵育l_2h或4°C過(guò)夜；
[0060] (2)棄包被液，用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液（PBS)洗板3次，3min/次；
[0061] (3)每孔加200yl含牛血清白蛋白的PBS，加蓋，37°C孵育l-2h;
[0062] (4)棄上清液，將板直接用于檢測(cè)；或放于密封袋中，置4°C保存，1周內(nèi)使用；
[0063](三）循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)：
[0064] (1)在包被的96孔板中加入：
[0065]a.待檢測(cè)孔：100y1細(xì)胞懸液；
[0066]b.陰性對(duì)照孔：100y1 1640培養(yǎng)液；
[0067]c.陽(yáng)性對(duì)照孔：100y1含1X105/ml的肝癌細(xì)胞株IfepG2;
[0068] (2)將96孔板放入濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱在37°C、5%C02培養(yǎng)18-24小時(shí)；
[0069] (3)將96孔板取出，棄培養(yǎng)上清液，用含0?1 %Tween的PBS洗板4次，3min/次；
[0070] (4)每個(gè)孔中加入100y1用1 %BSA的PBS稀釋的熒光素標(biāo)記AFP及EpCAM檢測(cè) 抗體，置37°C孵育1-2小時(shí)；
[0071] (5)孵育后用PBS洗3次，3min/次，洗板后甩干，加入100yl用PBS1 : 1000倍 稀釋的抗-FITC-490及SA-550抗體（二抗），置37°C孵育2小時(shí)；
[0072] (6)每孔加入50y1熒光防淬滅劑，放置于室溫閉光顯色；
[0073] (7)棄去熒光淬滅劑，將96孔濾膜板自然晾干。
[0074](四）結(jié)果觀察：
[0075] 使用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)每個(gè)反應(yīng)空孔中紅綠熒光斑點(diǎn)，每一個(gè)綠色熒光點(diǎn)代表一個(gè) 分泌AFP的細(xì)胞；每一個(gè)紅色熒光點(diǎn)代表一個(gè)分泌EpCAM的細(xì)胞。其中，熒光顯微鏡對(duì)于紅 綠熒光激發(fā)光波長(zhǎng)分別為：綠色熒光FITC(激發(fā)光波長(zhǎng)490nm/發(fā)射光波長(zhǎng)510nm)，紅色熒 光Cy3 (激發(fā)光波長(zhǎng)550nm/發(fā)射光波長(zhǎng)570nm)。
[0076] 結(jié)果判定：如果能檢測(cè)到AFP和EpCAM雙陽(yáng)性的細(xì)胞（紅綠熒光重合）即判定為 陽(yáng)性；如果檢測(cè)不到AFP和EpCAM雙陽(yáng)性的細(xì)胞則判定為陰性。
[0077] 結(jié)果如圖2所示，肝癌伴肺轉(zhuǎn)移患者標(biāo)本可見(jiàn)視野中有5個(gè)AFP與EpCAM雙陽(yáng)性 細(xì)胞（如箭頭所標(biāo)），判斷為肝癌轉(zhuǎn)移陽(yáng)性；而健康志愿者標(biāo)本則檢測(cè)不到AFP與EpCAM雙 陽(yáng)性細(xì)胞，判斷為陰性。上述結(jié)果表明，本試劑盒能夠較好地反映肝癌患者的轉(zhuǎn)移情況。
[0078] 實(shí)施例3
[0079] 分別對(duì)50例CTC陽(yáng)性的肝癌患者（病例組）和50例CTC陰性的肝癌患者（疾病 對(duì)照組）運(yùn)用本發(fā)明試劑盒（ELISP0T組）進(jìn)行鑒別診斷，從而初步判斷本發(fā)明在肝癌診斷 中的特異性和敏感性，從而判斷其臨床意義。其中，所有病例入選前使用目前常用的基于免 疫磁珠分離技術(shù)的CellSearch試劑盒進(jìn)行CTC檢測(cè)，其結(jié)果作為本試劑盒的參照標(biāo)準(zhǔn)。
[0080] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0081] (一）含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞群初分離：
[0082] (1)取4_5ml血液加入含肝素鈉或擰檬酸鈉的采血管，按抗凝劑：血液樣本體積比 1 : 9使用3. 8 %枸櫞酸鈉溶液抗凝；
[0083] (2)將含抗凝血的采血管顛倒混勻5次以上避免血液分層，按1 : 1-1 : 3的比例 將抗凝血加入含淋巴細(xì)胞分層液的無(wú)菌離心管中，形成明顯界面，在室溫下2000-3000rpm 離心 20_30min;
[0084] (3)可見(jiàn)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)存在于云霧狀層中，用無(wú)菌滴管吸取至新的干 凈離心管中；
[0085] (4)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CD45負(fù)分選的方法，在樣本準(zhǔn)備階段過(guò)濾掉白細(xì)胞以排除白細(xì)胞 對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響（注：CD45在所有白細(xì)胞上都有表達(dá)，稱為白細(xì)胞共同抗原）。向上述外 周單個(gè)核細(xì)胞混合液中加入BeadsBuffer中重懸，加入humanCD45MicroBeadsreagent， 輕柔混勾室溫孵化45min，使用magneticseparationcolumns去除⑶45+細(xì)胞，收集流出 的CD45-細(xì)胞；
[0086] (5)加入400yl預(yù)熱至37°C的含10X小牛血清的1640培養(yǎng)液重懸沉淀細(xì)胞，取 10y1細(xì)胞懸液加入40pl臺(tái)酚藍(lán)，取10y1臺(tái)酚藍(lán)混合細(xì)胞液加入血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下 計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)每ml懸液細(xì)胞數(shù)量，用預(yù)熱至37°C的含10X小牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞 懸液至（1-2)X105細(xì)胞/ml;
[0087](二）捕獲抗體預(yù)包被：
[0088] (1) 96孔板中加入1 : 60稀釋的AFP及EpCAM抗體（捕獲抗體）100y1/孔，加蓋 37°C孵育l_2h或4°C過(guò)夜；
[0089] (2)棄包被液，用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液（PBS)洗板3次，3min/次；
[0090] (3)每孔加200yl含牛血清白蛋白的PBS，加蓋，37°C孵育l-2h;
[0091] (4)棄上清液，將板直接用于檢測(cè)；或放于密封袋中，置4°C保存，1周內(nèi)使用；
[0092](三）循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)：
[0093] (1)在包被的96孔板中加入：
[0094]a.待檢測(cè)孔：100y1細(xì)胞懸液；
[0095]b.陰性對(duì)照孔：100y11640培養(yǎng)液；
[0096]c?陽(yáng)性對(duì)照孔：100y1含1X104/ml的肝癌細(xì)胞株H印G2;
[0097] (2)將96孔板放入濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱在37°C、5%C02培養(yǎng)18-24小時(shí)；
[0098] (3)將96孔板取出，棄培養(yǎng)上清液，用含0?1 %Tween的PBS洗板4次，3min/次；
[0099] (4)每個(gè)孔中加入100y1用1 %BSA的PBS稀釋的熒光素標(biāo)記AFP及EpCAM檢測(cè) 抗體，置37°C孵育1-2小時(shí)；
[0100] (5)孵育后用PBS洗3次，3min/次，洗板后甩干，加入100yl用PBS1 :1000倍稀 釋的抗-FITC-490及SA-550抗體（二抗），置37°C孵育2小時(shí)；
[0101] (6)每孔加入50y1熒光防淬滅劑，放置于室溫閉光顯色；
[0102] (7)棄去熒光淬滅劑，將96孔濾膜板自然晾干。
[0103] (四）結(jié)果觀察：
[0104] 使用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)每個(gè)反應(yīng)空孔中紅綠熒光斑點(diǎn)，每一個(gè)綠色熒光點(diǎn)代表一個(gè) 分泌AFP的細(xì)胞；每一個(gè)紅色熒光點(diǎn)代表一個(gè)分泌EpCAM的細(xì)胞。其中，熒光顯微鏡對(duì)于紅 綠熒光激發(fā)光波長(zhǎng)分別為：綠色熒光FITC(激發(fā)光波長(zhǎng)490nm/發(fā)射光波長(zhǎng)510nm)，紅色熒 光Cy3 (激發(fā)光波長(zhǎng)550nm/發(fā)射光波長(zhǎng)570nm)。
[0105] 結(jié)果判定：如果能檢測(cè)到AFP和EpCAM雙陽(yáng)性的細(xì)胞（紅綠熒光重合）即判定為 陽(yáng)性；如果檢測(cè)不到AFP和EpCAM雙陽(yáng)性的細(xì)胞則判定為陰性。具體見(jiàn)表1。
[0106] 表1ELISP0T試劑盒用于肝癌伴轉(zhuǎn)移患者的鑒別診斷
[0107]
[0108] 由表1可知，所有檢測(cè)結(jié)果均可以判斷其陰性或陽(yáng)性結(jié)果。其中，本試劑盒能夠 從50例CTC陽(yáng)性患者中檢測(cè)出46例（46/50);而對(duì)于50例CTC陰性患者則全部檢測(cè)不到 (0/50)。初步認(rèn)為運(yùn)用本發(fā)明對(duì)于肝癌診斷的特異性為100%，敏感性為92%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于固相酶聯(lián)免疫熒光斑點(diǎn)的肝癌診斷試劑盒，其特征在于：包括96孔濾膜 板、捕獲抗體、熒光標(biāo)記的檢測(cè)抗體、二抗、熒光防淬滅劑、CD45+磁珠及分選器、牛血清白蛋 白組成； 所述的捕獲抗體為兔抗人AFP和EpCAM捕獲抗體； 所述的熒光標(biāo)記的檢測(cè)抗體為FITC標(biāo)記的AFP捕獲抗體檢測(cè)抗體和Biotin標(biāo)記的 EpCAM捕獲抗體檢測(cè)抗體； 所述的二抗為抗-FITC-490及SA-550抗體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于固相酶聯(lián)免疫熒光斑點(diǎn)的肝癌診斷試劑盒，其特征 在于操作步驟如下： 1) 捕獲抗體預(yù)包被 96孔板中加入1 : 60稀釋的AFP及EpCAM抗體IOOyl/孔，加蓋37°C孵育l_2h或 4°C過(guò)夜，棄包被液，用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液洗板，每孔加200 y 1含牛血清白蛋白的PBS，加 蓋，37°C孵育l_2h，棄上清液，將板直接用于檢測(cè)； 2) 采集血液樣本，并分離得到含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞群； 3) 檢測(cè) 包被的96孔板中，待檢測(cè)孔加100 y 1細(xì)胞懸液，陰性對(duì)照孔加100 y 11640培養(yǎng)液，陽(yáng) 性對(duì)照孔加100 U 1含I X 104/ml的肝癌細(xì)胞株H印G2 ; 4) 將96孔板放入濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱在37°C、5% CO2培養(yǎng)18-24h，棄上清液，用含0. 1 % Tween的PBS洗板； 5) 每個(gè)孔中加入100 y 1用1 % BSA的PBS稀釋的熒光素標(biāo)記AFP及EpCAM檢測(cè)抗體， 置37°C孵育1-2小時(shí)； 6) 孵育后用PBS洗3次，3min/次，洗板后甩干，加入100 y 1用PBS 1 : 1000倍稀釋 的抗-FITC-490及SA-550抗體（二抗），置37°C孵育2小時(shí)； 7) 每孔加入50 y 1熒光防淬滅劑，放置于室溫閉光顯色； 8) 棄去熒光淬滅劑，將96孔濾膜板自然晾干； 9) 計(jì)數(shù)每個(gè)反應(yīng)空孔中紅綠重合斑點(diǎn)的個(gè)數(shù)，判斷結(jié)果。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于固相酶聯(lián)免疫熒光斑點(diǎn)的肝癌診斷試劑盒，其特征 在于：判斷方法為如果能檢測(cè)到AFP和EpCAM雙陽(yáng)性的細(xì)胞即判定為陽(yáng)性；如果檢測(cè)不到 AFP和EpCAM雙陽(yáng)性的細(xì)胞則判定為陰性。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于固相酶聯(lián)免疫熒光斑點(diǎn)的肝癌診斷試劑盒，利用外周血循環(huán)中有功能的肝癌細(xì)胞能夠主動(dòng)分泌AFP及EpCAM的特征，通過(guò)抗體捕獲，然后根據(jù)產(chǎn)生的紅綠熒光斑點(diǎn)數(shù)用熒光顯微鏡判讀結(jié)果，可用于檢測(cè)受檢者外周血中是否存在游離、有功能的肝癌細(xì)胞，用于肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的提前預(yù)警。
【IPC分類(lèi)】G01N33/574, G01N21/64
【公開(kāi)號(hào)】CN104990905
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510366114
【發(fā)明人】曲凱, 劉昌 , 王志鑫, 林婷, 黃啟超, 季樂(lè)樂(lè)
【申請(qǐng)人】曲凱
【公開(kāi)日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年6月30日