透析24h，除去未與白蛋 白結(jié)合的ITCBE;
[0160] 5)將步驟4)所得的液體用lmol/LHC1調(diào)節(jié)pH值至7. 0,然后緩慢逐漸滴加80y1 的lmmol/L鎳離子溶液，邊滴加邊振蕩，以免鎳離子使蛋白變性沉淀；
[0161] 6)將步驟5)所得的溶液置于溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為100r/min的搖床中反應(yīng)2h，用 透析袋進(jìn)行透析24h;
[0162] 7)將步驟6)透析后的液體于-20°C分裝保存，得到反應(yīng)溶液。
[0163] B)純化鎳-白蛋白螯合物的提?。翰捎妹庖哂H和層析法，去除反應(yīng)溶液（即步驟 7)得到的反應(yīng)溶液）中未反應(yīng)的白蛋白以及多余的鎳離子，即得鎳-白蛋白螯合物，具體步 驟如下：
[0164] (1)溶解樣品：向經(jīng)過(guò)步驟7)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水使鎳-白蛋白螯合 物復(fù)溶；
[0165] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與白蛋 白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0166] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，白蛋白 與填料特異性結(jié)合；
[0167] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.lmol/L的磷 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液I;
[0168] (5)收集：收集洗脫液I;
[0169](6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用ddH20透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過(guò)夜，收集樣本；
[0170] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鎳特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0171] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（6)中樣本，然后上柱；
[0172] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0.5-1.Omol/L的磷 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液II;
[0173] (10)收集：收集洗脫液II;
[0174] (11)透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用2升ddH20透析除鹽，換 水三次后，4°C透析過(guò)夜，收集樣本，即得鎳-白蛋白螯合物；
[0175] C)對(duì)鎳-白蛋白螯合物的鑒定，具體步驟如下：
[0176] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)制備膠床；
[0177] (2)加樣：取步驟B)中8yL提取純化得到的鎳-白蛋白螯合物，加入2yL上樣 緩沖液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0178] (3)電泳：連接電泳板，加入電泳緩沖液進(jìn)行電泳；電泳過(guò)程中，電流為22mA恒流， 環(huán)境溫度為4°C;電泳至溴酚藍(lán)移至膠底部時(shí)停止電泳；
[0179] (4)檢測(cè)：在膠床上找出含鎳的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測(cè)是否含有鎳以及檢測(cè)鎳的含量。
[0180] D)檢測(cè)結(jié)果
[0181] (1)石墨爐原子吸收光譜法（AAS)初步測(cè)定HSA中重金屬含量：結(jié)果見表1
[0182] 表1為白蛋白中重金屬含量（yg/L)
[0183]
[0184] (2)電泳結(jié)果：
[0185] 其中，圖1為本發(fā)明所述的鎳-白蛋白螯合物的非變性電泳條帶圖。
[0186] 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE)或稱為活性電泳是在不加入SDS和疏 基乙醇等變性劑的條件下，對(duì)保持活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于酶的鑒 定、同工酶分析和提純。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過(guò) 程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據(jù)其電泳迀移率的不同和凝膠的分子篩作 用，因而可以得到較高的分辨率，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子 的生物活性，因此右邊泳道M為變性Marker，只用于檢測(cè)，沒(méi)有標(biāo)記作用，泳道1為白蛋白的 條帶。
[0187] (3)同步輻射X熒光分析：
[0188] 蛋白條帶內(nèi)微量元素含量的SRXRF分析在北京正負(fù)電子對(duì)撞機(jī)（BEPC)的4W1〃 同步輻射束線上完成。儲(chǔ)存環(huán)中電子束流能量為2. 2GeV，束流強(qiáng)度100mA。樣品移動(dòng)臺(tái) (TSA200型，北京卓立漢光公司）可在計(jì)算機(jī)控制的步進(jìn)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)下沿X、Y二維方向上移 動(dòng)以改變?nèi)肷涔獍呶恢?，移?dòng)步長(zhǎng)為〇. 〇〇25_。從樣品發(fā)射出的X射線由Si(Li)探測(cè)器 (PGTInc.LS30143-DS)探測(cè)，探頭與入射SR線共平面且相互垂直，距樣品照射點(diǎn)20mm，信 號(hào)用PGT多道分析儀（MCA4000)獲取輸出。用11. 5keV的單色同步輻射光激發(fā)樣品，調(diào)節(jié) 入射光斑（lmmx3mm)位置使之處于條帶一端，在300s的測(cè)定時(shí)間內(nèi)，光斑一直沿條帶均勾 緩慢移動(dòng)，計(jì)數(shù)結(jié)束時(shí)光斑移到該條帶另一端。沿電泳方向每1mm取一個(gè)譜。采用AXIL 軟件處理數(shù)據(jù)，并用來(lái)源于空氣且含量恒定的Ar信號(hào)峰對(duì)其它元素峰進(jìn)行歸一處理，以抵 消束流強(qiáng)度變化對(duì)信號(hào)強(qiáng)弱產(chǎn)生的影響。在相同的條件下以同樣的方式測(cè)量定量標(biāo)準(zhǔn)干膠 膜的熒光譜。
[0189] 圖2為本發(fā)明所述的鎳-白蛋白螯合物的電泳條帶的同步輻射X線熒光分析圖， 圖中橫坐標(biāo)為蛋白條帶位置，縱坐標(biāo)為該條帶各金屬能量（含量）值。
[0190]本發(fā)明一種宙量檢測(cè)鎳-白蛋白罄合物的方法的檢測(cè)條件的確宙：
[0191] 1.抗白蛋白抗體、抗鎳抗體最佳工作濃度以及血漿的最佳稀釋倍數(shù)的確定
[0192] 步驟如下：
[0193] (1)將抗HSAAb用稀釋緩沖液按照抗HSAAb與稀釋緩沖液的質(zhì)量體積比為 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000進(jìn)行稀釋，加入ELISA板微孔中，將抗HSAAb包被于固相載 體上，每個(gè)濃度包被三排，4°C過(guò)夜18小時(shí)；
[0194] (2)移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，用2%牛血清白蛋白 作為封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌；
[0195] (3)待檢樣品按待檢樣品與稀釋緩沖液的質(zhì)量體積比為1:10、1:20、1:40進(jìn)行稀 釋，加入微孔中，按照上述包被的抗HSAAb濃度，同一個(gè)濃度的抗HSAAb的分別加入不同 稀釋度血漿，37°C作用1小時(shí)；
[0196] (4)移去待檢樣品，并用洗潘液進(jìn)彳丁洗潘，待洗潘完成后，加入抗NiAb，抗NiAb 按抗NiAb與稀釋緩沖液的質(zhì)量體積比為1:5000、1:10000、1:20000、1:40000進(jìn)行稀釋，按 照每一個(gè)相同抗HSAAb、血清稀釋濃度，不同濃度抗NiAb各加2孔，37°C作用1小時(shí)，使抗 NiAb與HSA上的金屬鎳反應(yīng)；
[0197] (5)酶標(biāo)抗體選擇最適工作濃度，即2iig/mL，移去抗Ni抗體，并用洗滌液進(jìn)行洗 滌，待洗滌完成后，加入用稀釋緩沖液稀釋HRP酶標(biāo)抗體，37°C作用1小時(shí)，使HRP酶標(biāo)抗體 與鎳-白蛋白螯合物反應(yīng)；
[0198] (6)移去酶標(biāo)抗體，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入底物，37°C避光作用 30分鐘；
[0199] (7)將終止液滴加至每一微孔；
[0200] (8)取波長(zhǎng)405nm，加完終止液后，將ELISA板置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)，分別讀取各孔0D 值。根據(jù)各孔0D值數(shù)值，選擇抗HSAAb、抗NiAb的最佳工作濃度以及血漿的最佳稀釋倍 數(shù)。
[0201] 試驗(yàn)中同時(shí)以所制標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，選擇抗HSAAb+封閉+抗NiAb+酶標(biāo)+ 底物（即不加待檢樣品）作為陰性對(duì)照1 ;抗HSAAb+封閉+血漿+酶標(biāo)+底物（即不加抗 NiAb)作為陰性對(duì)照2 ;抗HSAAb+封閉+酶標(biāo)+底物（即不加待檢樣品和抗NiAb)作為 陰性對(duì)照3 ;抗HSAAb+封閉+血漿+抗NiAb+底物（即不加酶標(biāo)）作為陰性對(duì)照4 ;封閉 +血漿+抗NiAb+酶標(biāo)+底物（即不加抗HSAAb捕獲HSA)作為空白對(duì)照1 ;只加底物作 為空白對(duì)照2及PBS作為空白對(duì)照3。檢測(cè)結(jié)果見表2-3。
[0202] 表2 :棋盤滴定法確定抗HSAAb、抗NiAb的最佳工作濃度以及血漿的最佳稀釋倍 數(shù)的數(shù)據(jù)（每個(gè)數(shù)據(jù)皆為平均值）
[0203]
[0207] 由表2-3數(shù)據(jù)顯示，我們可以看出當(dāng)抗HSAAb的稀釋度為1:2000、全血稀釋度為 1:20、Ni抗稀釋度為1:10000時(shí)，0D值最大，所以選此值所對(duì)應(yīng)的濃度作為最佳工作濃度。
[0208] 2.定量檢測(cè)鎳-白蛋白螯合物的方法中方法二、三中洗脫液最佳工作濃度及洗脫 時(shí)間的確定
[0209] 步驟如下：（1)包被：將抗NiAb用稀釋緩沖液稀釋至10000倍（質(zhì)量體積比），加 入ELISA板微孔中，37°C水浴3小時(shí)，儲(chǔ)存冰箱；
[0210] (2)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，用2%牛血清白 蛋白作為封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌；
[0211] (3)移去封閉液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入用稀釋緩沖液稀釋的 酶標(biāo)抗體，酶標(biāo)抗體稀釋至濃度為2 y g/mL，37°C作用2小時(shí)，使其與抗NiAb反應(yīng)；
[0212] (4)準(zhǔn)備洗脫液：將木瓜蛋白酶用pH8.0,0.lmol/LTris-HCI緩沖液配制成 100ng/ml，再加入lmmol/L二硫蘇糖醇（DIT)37°C孵育 30min;
[0213] (5)移去酶標(biāo)抗體，用稀釋緩沖液對(duì)洗脫液進(jìn)行稀釋，使洗脫液中的木瓜蛋白酶的 濃度與酶標(biāo)抗體的濃度之比為1:80、1:40、1:20、1:10、1:5 (其中每個(gè)濃度作3個(gè)復(fù)孔），分 別放置于37°C溫度下洗脫lh、2h、3h;
[0214] (6)移去洗脫液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入底物，37°C避光作用 30分鐘；
[0215] (7)將終止液滴加至每一微孔；
[0216] (8)取405nm波長(zhǎng)，加完終止液后，將ELISA板置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)，分別讀取每組 0D值，通過(guò)與PBS緩沖液組比較，比較出洗脫液的最適濃度及洗脫時(shí)間，具體結(jié)果參見表4。
[0217] 表4 :ELISA洗脫液最佳工作濃度及洗脫時(shí)間確定
[0218]
[0220] 從表4中我們可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)洗脫液中的木瓜蛋白酶的濃度與酶標(biāo)抗體的濃度之比 =1:20時(shí)，各