組0D值均低于其他幾組，說(shuō)明該濃度洗脫液洗脫效果最優(yōu)（即將ELISA孔 壁上結(jié)合的抗NiAb-酶標(biāo)復(fù)合物洗脫程度達(dá)到最大，因而0D值最低）；而洗脫時(shí)間不管是 lh、2h、3h，各組0D值變化均不大，可見隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸減弱，在酶濃度不變的 情況下，延長(zhǎng)消化時(shí)間并不能提高消化率，所以本試驗(yàn)中洗脫液的洗脫時(shí)間為l_3h皆可。
[0221] 應(yīng)用實(shí)施例1
[0222] 取采用ELISA法檢測(cè)100份標(biāo)本血漿中的鎳-白蛋白螯合物，按照以下步驟進(jìn)行 檢測(cè)：酶聯(lián)免疫法（ELISA法）檢測(cè)鎳-白蛋白螯合物，按照如下步驟檢測(cè)：
[0223] 1)將抗HSAAb包被于固相載體上：用稀釋緩沖液將抗HSAAb稀釋至2000倍，加 入ELISA板微孔中，37°C水浴1小時(shí)，儲(chǔ)存冰箱；
[0224]2)從循環(huán)系統(tǒng)取全血，作待檢樣品，lOOOrmp離心5-8分鐘，離心棄去沉淀， lOOOrmp離心5-8分鐘，離心棄去沉淀，lOOOrmp離心5-8分鐘，離心棄去沉淀，lOOOrmp離心 5-8分鐘，離心棄去沉淀；
[0225] 3)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加2%牛血清白 蛋白作為封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，洗滌完成后，ELISA 板于37°C放置1小時(shí)；
[0226] 4)加待檢樣品，并且溫育：加入步驟2)中的待檢樣品、以已知含量的鎳-白蛋白 螯合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液稀釋將待檢樣品稀釋至20倍，加入微孔中，37°C作用1小 時(shí)；
[0227] 5)加入可以捕獲鎳的物質(zhì)，并且溫育：移去待檢樣品，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗 滌完成后，加入用稀釋緩沖液稀釋10000倍，37°C作用1小時(shí)，使抗NiAb與白蛋白上的金 屬鎳反應(yīng)；
[0228] 6)酶結(jié)合物溫育：移去抗鎳抗體，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入用稀 釋緩沖液稀釋的HRP酶標(biāo)抗體，37°C作用1小時(shí)，使其與酶標(biāo)抗體反應(yīng)；
[0229] 7)底物溫育：移去酶標(biāo)抗體，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入底物， 37°C避光作用30分鐘；
[0230] 8)終止反應(yīng)：將終止液滴加至每一微孔；
[0231] 9)取波長(zhǎng)為405nm，加完終止液后，將ELISA板置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)，分別讀取待檢 樣品0D值（也可不使用酶標(biāo)儀，直接通過(guò)顯色情況進(jìn)行定性檢測(cè)），具體檢測(cè)值如表5所 不。
[0232] 表5 :100份血樣標(biāo)本中鎳-白蛋白螯合物的ELISA檢測(cè)結(jié)果
[0233]
[0235]應(yīng)用實(shí)施例2
[0236] 采用酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法（ELISA法+AAS法）檢測(cè)100分標(biāo)本血樣中 的鎳-白蛋白螯合物，按照如下步驟檢測(cè)：
[0237] 1)將能夠捕獲白蛋白的物質(zhì)，如抗白蛋白抗體（抗HSAAb)包被于固相載體上： 用稀釋緩沖液將抗HSAAb稀釋至2000倍，加入ELISA板微孔中，4°C過(guò)夜18小時(shí)；
[0238] 2)從循環(huán)系統(tǒng)取全血，作待檢樣品，lOOOrmp離心5-8分鐘，離心棄去沉淀， lOOOrmp離心5-8分鐘，離心棄去沉淀，lOOOrmp離心5-8分鐘，離心棄去沉淀，lOOOrmp離心 5-8分鐘，離心棄去沉淀；
[0239] 3)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入2%牛血清 白蛋白或脫脂奶粉作為封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，洗滌 完成后，ELISA板于37°C放置1小時(shí)；
[0240] 4)加待檢樣品，并且溫育：加入步驟2)中的待檢樣品、以已知含量的鎳-白蛋白 螯合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液將待檢樣品稀釋至20倍，加入微孔中，37°C作用1小時(shí)；
[0241] 5)洗脫：移去待檢樣品，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入木瓜蛋白酶濃 度為100ng/ml的洗脫液，洗脫1-3小時(shí)；
[0242] 6)檢測(cè)：從ELISA板的微孔中取樣，于原子吸收光譜儀檢測(cè)螯合于白蛋白上的鎳， 檢測(cè)值如表6所示。
[0243] 表6 :100份血樣標(biāo)本中鎳-白蛋白螯合物的AAS檢測(cè)結(jié)果
[0244]
[0246] 應(yīng)用實(shí)施例3
[0247] 采用酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法（ELISA法+ICP-MS法）檢測(cè)100 分標(biāo)本血樣中的鎳-白蛋白螯合物含量，按照如下步驟檢測(cè)：
[0248] 1)將能夠捕獲白蛋白的物質(zhì)，如抗白蛋白抗體（抗HSAAb)包被于固相載體上： 用稀釋緩沖液將抗HSAAb稀釋至2000倍，加入ELISA板微孔中，4°C過(guò)夜18小時(shí)；
[0249] 2)取100份標(biāo)準(zhǔn)血樣作為待檢樣品；
[0250] 3)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入2%牛血 清白蛋白作為封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，洗滌完成后， ELISA板于37°C放置1小時(shí)；
[0251] 4)加待檢樣品，并且溫育：加入步驟2)中的待檢樣品、以已知含量的鎳-白蛋白 螯合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液將待檢樣品稀釋至20倍，加入微孔中，37°C作用1小時(shí)；
[0252] 5)洗脫：移去待檢樣品，并用洗滌液進(jìn)行洗滌，待洗滌完成后，加入木瓜蛋白酶濃 度為100ng/ml的洗脫液，洗脫1-3小時(shí)；
[0253] 6)酸化：在步驟5)中的溶液中加入硝酸對(duì)溶液進(jìn)行酸化，封口過(guò)夜，徹底酸化，加 入過(guò)氧化氫，并且加熱趕酸；
[0254] 7)檢測(cè)：從步驟6)得到的溶液中取樣，于電感耦合等離子體質(zhì)譜儀下檢測(cè)螯合于 白蛋白的鎳，檢測(cè)值如表7所示。
[0255] 表7 :100份血樣標(biāo)本中鎳-白蛋白螯合物的ICP-MS檢測(cè)結(jié)果
[0256]
[0258] 對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種 相應(yīng)的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鎳-白蛋白螯合物，其特征在于，鎳離子與白蛋白通過(guò)巰基或/和半胱氨酸殘基 螯合而成。2. -種如權(quán)利要求1所述的鎳-白蛋白螯合物的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟： A) 鎳與白蛋白的螯合反應(yīng)：在提純?cè)从谌梭w的白蛋白或按照生物學(xué)方法重組的白蛋 白中加入鎳離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液； B) 純化鎳-白蛋白螯合物的提?。翰捎妹庖哂H和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反應(yīng)的白 蛋白以及多余的鎳離子，即得鎳-白蛋白螯合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于， 所述步驟B)具體如下： (1) 溶解樣品：向經(jīng)過(guò)步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水使鎳-白蛋白螯合物復(fù) 溶； (2) 平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與白蛋白特 異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱； (3) 上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，白蛋白與填 料特異性結(jié)合； (4) 洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷酸鹽 溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液I ; (5) 收集：收集洗脫液I ; (6) 透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后， 4 °C透析過(guò)夜，收集樣本； (7) 平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能與鎳 特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱； (8) 上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（6)中樣本，然后上柱； (9) 洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷酸鹽 溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液II ; (10) 收集：收集洗脫液II ; (11) 透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后， 4°C透析過(guò)夜，收集樣本，即得鎳-白蛋白螯合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鎳-白蛋白螯合物的制備方法，其特征在于，還包括步驟C): 對(duì)鎳-白蛋白螯合物的鑒定； 其中，步驟C)中具體如下： (1) 制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床； (2) 加樣：取步驟B)中提取純化得到的鎳-白蛋白螯合物，加入稀釋緩沖液，并混勻， 然后加樣于樣品槽中； (3) 電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳； (4) 檢測(cè)：在膠床上找出含鎳的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測(cè)是否含有鎳以及檢測(cè)鎳的含量。5. -種如權(quán)利要求1所述的鎳-白蛋白螯合物在制備檢測(cè)血樣中鎳-白蛋白螯合物的 試劑或試劑盒中的應(yīng)用。6. -種至少包括如權(quán)利要求1所述的鎳-白蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑盒。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括包被液，該包被液含有捕獲白蛋 白的物質(zhì)或捕獲鎳的物質(zhì)。8. -種定量檢測(cè)鎳-白蛋白螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的權(quán)利要求1所述 的鎳-白蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免 疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鎳-白蛋白螯 合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鎳-白蛋白螯合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純鎳-白蛋白螯 合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子 體質(zhì)譜結(jié)合法。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鎳-白蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用，該鎳-白蛋白螯合物是鎳離子與白蛋白通過(guò)巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。本發(fā)明建立了鎳-白蛋白螯合物的定性定量檢測(cè)方法，以便定量檢測(cè)鎳-白蛋白螯合物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鎳污染程度的應(yīng)用。通過(guò)定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中鎳-白蛋白螯合物可以間接反映這個(gè)地區(qū)人群受鎳污染的情況，從而間接反映這個(gè)地區(qū)鎳污染程度。本發(fā)明建立的鎳-白蛋白螯合物定量檢測(cè)方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使檢測(cè)的重復(fù)性得到大大提高。
【IPC分類】G01N27/447, G01N1/28, G01N27/62, G01N21/31, G01N33/53
【公開號(hào)】CN105021549
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510411356
【發(fā)明人】張積仁, 陽(yáng)帆, 董欣敏, 吳婧, 蔡睿, 孫遙, 趙乙木
【申請(qǐng)人】上海拜豪生物科技有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年7月14日