一種吡哌酸的elisa檢測方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全技術領域。更具體地，涉及一種吡哌酸的ELISA檢測方法及 應用。
【背景技術】
[0002] 吡哌酸（Pipemidic Acid，簡稱PPA)，為微黃色或淡黃色的結晶性粉末，無臭，味 苦，是人工合成的第二代喹諾酮類抗菌藥。該藥由2, 4-二氯嘧啶-5-羧酸乙酯與β -乙氨 基丙酸乙酯縮合環(huán)化為2-氯-5-羥基-7, 8-二氫-8-乙基吡啶[2, 3-d]嘧啶-6-羧酸酯， 然后溴化后與哌嗪縮合、水解、中和而得。吡哌酸分子式為C14H17N 5O3，分子量：303. 32,其結 構式如式（III)所示：
[0003] 吡哌酸對綠膿桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌等革蘭陰性桿菌有較強的抗菌作用，用于 治療泌尿道感染及耳鼻喉科干擾等病癥。吡哌酸作為一種喹諾酮類（QNs)藥物，因其能抑 制細菌DNA螺旋酶、抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透力強，抗菌作用是磺胺類藥的近千倍， 且其為化學合成藥物，價格低廉，故在醫(yī)學和獸醫(yī)學很快取得廣泛應用，尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中 成為最重要的抗感染藥物之一。QNs藥物對動物體以及人體的絕大部分器官和組織都有不 同程度的不良反應：由于QNs藥物呈脂溶性，可通過血腦屏障進入腦組織，抑制γ -氨基丁 酸（GABA)與其受體結合而產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)反應。故以神經(jīng)系統(tǒng)的損傷最為常見，其次是皮膚 及其附件的損傷。多數(shù)不良反應癥狀較輕，且可逆，但也有較重甚至危及生命的。動物實驗 表明，QNs藥物可引起幼畜關節(jié)炎、跟腱炎、也能引起過敏性休克，惡心嘔吐，靜脈炎等癥狀 以及某些潛在的致癌性質，同時由于致病菌產(chǎn)生的耐藥性，吡哌酸藥物的殘留問題引起廣 泛關注。我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定大部分喹諾酮類藥物的最高殘留限量為100 μ g/ L，歐盟也規(guī)定 喹諾酮類藥物的最高殘留限量大多為100 μ g/ kg。
[0004] 目前，國內外對食品中吡哌酸的常用檢測方法是液相色譜-質譜/質譜法、共振散 射光譜法和電化學法。
[0005] 但是由于色譜法的樣品前處理復雜繁瑣，并且儀器昂貴，成本高，不能實現(xiàn)對吡哌 酸進行快速、高效的檢測和監(jiān)測。而共振散射光譜法和電化學法的檢測靈敏度較低，對試 劑、環(huán)境要求高，無法滿足吡哌酸的檢測要求。如陳珍珊等采用反相離子對高效液相色譜 法測定吡哌酸片的含量，所建方法線性范圍為1. 069~8. 552 μ g/mL，藥品樣品回收率為 99. 5%。然而該法的儀器昂貴，成本高，耗時長，不能實現(xiàn)對吡哌酸高效快速的檢測和監(jiān)控。 Shi-Lu Chen等采用流動注射化學發(fā)光法測定尿液和藥片中的吡哌酸，所建方法檢測范圍 為3· O X 10 9~8· O X 10 7 mol/L，檢測限為6· 7 X 10 1(] mol/L，然而該法的選擇性不高，有時 需和分離方法結合，對試劑、環(huán)境要求高，且對食品樣品的前處理復雜繁瑣，無法滿足吡哌 酸的快速檢測要求。Solangi等采用溶出伏安法同時檢測藥品中的吡哌酸和氧氟沙星，所建 方法的檢測范圍均為10~100 yg/mL，檢出限為50 ng/mL和I yg/mL，該法也可用于人 尿的檢測，然而，該法的檢測靈敏度較低，無法滿足吡哌酸的快速檢測要求。專利《用共振散 射光譜測定吡哌酸的方法》(【申請?zhí)枴?01210108204. 8)，利用吡哌酸與四苯硼鈉在pH 3. 6的 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中形成離子締合物微粒，該微粒在480 nm波長處產(chǎn)生一個共振散射 光譜峰，且共振散射強度與吡哌酸濃度呈線性關系，據(jù)此建立的一個測定吡哌酸含量的共 振散射光譜分析方法，該法測定啦哌酸的線性范圍為I. 〇~95 μ g/mL，檢出限為0. 5 μ g/ mL。這種方法的檢測限較高，未能滿足吡哌酸檢測要求。
[0006] 因此，為了實現(xiàn)吡哌酸快速檢測，有必要研制建立一種更加簡單快捷方便、高靈敏 度和高特異性的吡哌酸檢測方法。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術中吡哌酸檢測方法的的缺陷和不足，提 供一種用于快速簡便檢測吡哌酸的免疫檢測方法。所述免疫檢測方法是采用異源模式，利 用吡哌酸抗體與非吡哌酸包被原組合的，利用最優(yōu)組合建立的吡哌酸ELISA檢測方法可方 便、快捷、準確、特異地檢測出食品中是否含有吡哌酸。
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種吡哌酸的人工抗原。
[0009] 本發(fā)明另一目的是提供一種吡哌酸的ELISA檢測方法及應用。
[0010] 本發(fā)明的再一目的是提供上述吡哌酸的ELISA檢測方法的應用。
[0011] 本發(fā)明還提供了檢測吡哌酸的幾種樣品的前處理方法。
[0012] 本發(fā)明上述目的通過以下技術方案實現(xiàn)： 一種吡哌酸的ELISA檢測方法，是采用異源模式，利用吡哌酸抗體和包被原組合的 ELISA檢測體系建立的；所述包被原為吡哌酸包被原或喹諾酮類包被原。
[0013] 其中，所述吡哌酸抗體是利用吡哌酸免疫原制備得到，所述吡哌酸免疫原是以吡 哌酸為半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到；所述吡哌酸包被原是以吡哌酸為半抗原與載體蛋白偶 聯(lián)得到；所述喹諾酮類包被原是以喹諾酮類為半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到。
[0014] 優(yōu)選地，所述載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA)或卵清蛋白（0VA)。
[0015] 更優(yōu)選地，所述吡哌酸免疫原是以吡哌酸為半抗原，通過碳二亞胺法（EDC法）與 牛血清白蛋白（BSA)偶聯(lián)得到；所述吡哌酸包被原是以吡哌酸為半抗原，通過碳二亞胺法 (EDC法）與卵清蛋白（OVA)偶聯(lián)得到；所述喹諾酮類包被原是以喹諾酮類為半抗原，通過碳 二亞胺法（EDC法）與卵清蛋白（OVA)偶聯(lián)得到。
[0016] 更進一步優(yōu)選地，所述喹諾酮類是環(huán)丙沙星、帕珠沙星、加替沙星、洛美沙星、沙拉 沙星或格林沙星。
[0017] 具體地，本發(fā)明上述吡哌酸ELISA檢測方法，是利用吡哌酸抗體分別與7種包被 原（同源包被原和異源包被原）組合，優(yōu)選出特異性、靈敏度最高的組合，并以此為基礎，建 立ELISA檢測方法。
[0018] 所優(yōu)選出來的最佳方案為異源模式，即利用吡哌酸抗體與異源包被原組合，最佳 組合為以吡哌酸免疫原制備的吡哌酸抗體與異源包被原洛美沙星-OVA的組合；所述吡哌 酸免疫原是以吡哌酸為半抗原，通過碳二亞胺法（EDC法）與牛血清白蛋白（BSA)偶聯(lián)得到； 所述異源包被原洛美沙星-OVA是以洛美沙星為半抗原，通過碳二亞胺法（EDC法)與卵清蛋 白（OVA)偶聯(lián)得到。該最佳組合建立的吡哌酸ELISA檢測方法的特異性、靈敏度最高。
[0019] 另外，優(yōu)選地，上述采用碳二亞胺法制備吡哌酸免疫原的具體步驟如下： 51. 將吡哌酸(半抗原)和1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC)溶于加入了一 定量氫氧化鈉的磷酸鹽緩沖溶液中，記為A液，載體蛋白溶于磷酸鹽緩沖液中，記為B液； 52. 將A液加入B液中，常溫攪拌反應20~40 min ; 53. 待步驟S2反應完成后，將反應后混合液裝入透析袋，用磷酸鹽緩沖溶液透析即得 目的產(chǎn)物吡哌酸-BSA或吡哌酸-0VA。
[0020] 上述采用碳二亞胺法制備喹諾酮類的人工抗原的具體步驟如下： 51. 將喹諾酮類(半抗原）溶于磷酸鹽緩沖溶液中，并加入載體蛋白OVA ; 52. 將1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺加入Sl所述溶液中，室溫攪拌反應20~ 40 min ； 53. 待步驟S2反應完成后，將反應后混合液分別裝入透析袋，用磷酸鹽緩沖溶液透 析即得目的產(chǎn)物環(huán)丙沙星-0VA、帕珠沙星-0VA、加替沙星-0VA、洛美沙星-0VA、沙拉沙 星-0VA、格林沙星-0VA。
[0021] 具體應用時，利用本發(fā)明上述吡哌酸的ELISA檢測方法進行吡哌酸檢測的操作包 括如下步驟： 51. 待測樣品前處理； 52. 利用權利要求1所述吡哌酸抗體和包被原組合的ELISA檢測體系進行檢測。
[0022] 其中，所述待測樣品優(yōu)選為牛奶、雞蛋、雞肉或豬肉。
[0023] 優(yōu)選地，當待測樣品為牛奶時，樣品前處理方法具體步驟如下：吸取待測樣品牛 奶，按照吡哌酸標準品：待測樣品為30~400 ng/g的比例，加入吡哌酸標準品，以10000 r/ min離心10 min，撥去脂肪層，吸取上層清液，用PBS稀釋20倍后進行檢測。
[0024] 當待測樣品為雞蛋時，樣品前處理方法具體步驟如下：取雞蛋蛋液充分勻漿，按照 吡哌酸標準品：待測樣品為30~400 ng/g的比例，加入吡哌酸標準品，再加入提取液混勻 (提取液為體積比1 :1的pH7. 4 PBS緩沖液和甲醇混合液)，渦旋30 s后振蕩30 min ;以 4000 r/min離心10 min，取上層清液稀釋10倍后進行檢測（如果不能及時檢測，可將得到 的上