層清液置于4°C冰箱保存，在檢測(cè)前將樣品取出，以4000 r/min離心10 min后，取上層 清液稀釋10倍后進(jìn)行檢測(cè))。
[0025] 當(dāng)待測(cè)樣品為雞肉或豬肉時(shí)，樣品前處理方法具體步驟如下：將雞肉或豬肉勻漿 后，按照吡哌酸標(biāo)準(zhǔn)品：待測(cè)樣品為30~400 ng/g的比例，加入吡哌酸標(biāo)準(zhǔn)品，再加入提取 液混勻（提取液為體積比為9:1的pH7. 4 PBS緩沖液和0.1 mol/L NaOH溶液的混合液)，渦 旋I min后以8000 r/min離心10 min，吸取上層清液，沉淀用提取液重復(fù)提取一次，步驟同 上，合并上清液用PBS稀釋5倍后進(jìn)行檢測(cè)。
[0026] 另外，上述吡哌酸的ELISA檢測(cè)方法在檢測(cè)吡哌酸中的應(yīng)用，以及在構(gòu)建吡哌酸 檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，也都應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0027] -種吡哌酸人工抗原（吡哌酸-載體蛋白）也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，其結(jié)構(gòu) 式如式（I)所示：
優(yōu)選地，式中的載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA)。
[0028] 該吡哌酸人工抗原在檢測(cè)吡哌酸或建立吡哌酸檢測(cè)方法及其試劑盒中的應(yīng)用也 應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0029] 由該吡哌酸人工抗原制備得到的吡哌酸抗體，以及所制備的吡哌酸抗體在檢測(cè)吡 哌酸或建立吡哌酸檢測(cè)方法及其試劑盒中的應(yīng)用也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0030] -種洛美沙星人工抗原(洛美沙星-載體蛋白）也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，其 結(jié)構(gòu)式如式（II)所示：
優(yōu)選地，式中的載體蛋白為卵清蛋白（0VA)。
[0031] 該洛美沙星人工抗原在檢測(cè)吡哌酸或建立吡哌酸檢測(cè)方法及其試劑盒中的應(yīng)用 也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0032] 具體是，以上述吡哌酸人工抗原為免疫原制備的抗體，以上述洛美沙星人工抗原 為包被原的組合在檢測(cè)吡哌酸或在建立吡哌酸檢測(cè)方法中的應(yīng)用，在本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
[0033] 本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明采用異源模式，利用吡哌酸抗體和非吡哌酸包被原組合，選取吡哌酸抗體和包 被原洛美沙星-OVA為最優(yōu)組合，建立了一種更加靈敏的檢測(cè)模式，提供了一種檢測(cè)吡哌酸 的有效方法，建立了一種高效、方便、簡(jiǎn)潔、高靈敏和高特異性的ELISA檢測(cè)方法。
[0034] 本發(fā)明所建ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)的線性范圍（IC2。~IC 8。）為0. 9~38. 5 ng/mL， 半抑制濃度（IC5。）為5.99 ng/mL，最低檢測(cè)限為0.31 ng/mL。
[0035] 本發(fā)明所建ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)食品中的吡哌酸的前處理方法操作較為簡(jiǎn)單， 使用較低的稀釋倍數(shù)便可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，減少處理過(guò)程中吡哌酸樣品的損失，添加回收率在 78. 64~109. 59%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD)為3. 8~16. 04%，說(shuō)明所建立的ELISA檢測(cè)方 法完全能夠滿足殘留檢測(cè)的要求，可應(yīng)用于快速檢測(cè)食品中非法添加的吡哌酸，具有廣闊 的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1為人工抗原(免疫原吡哌酸-BSA和包被原吡哌酸-OVA)、BSA、0VA、吡哌酸的 200~400 nm紫外掃描鑒定曲線。
[0037] 圖2為人工抗原(包被原環(huán)丙沙星-OVA)、0VA、環(huán)丙沙星的200~400 nm紫外掃描 鑒定曲線。
[0038] 圖3為人工抗原(包被原帕珠沙星-OVA)、0VA、帕珠沙星的200~400 nm紫外掃描 鑒定曲線。
[0039] 圖4為人工抗原(包被原加替沙星-OVA)、0VA、加替沙星的200~400 nm紫外掃描 鑒定曲線。
[0040] 圖5為人工抗原(包被原洛美沙星-OVA)、0VA、洛美沙星的200~400 nm紫外掃描 鑒定曲線。
[0041] 圖6為人工抗原(包被原沙拉沙星-OVA)、0VA、沙拉沙星的200~400 nm紫外掃描 鑒定曲線。
[0042] 圖7為人工抗原(包被原格林沙星-OVA)、0VA、格林沙星的200~400 nm紫外掃描 鑒定曲線。
[0043] 圖8為間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)測(cè)定吡哌酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0044] 圖9為以牛奶為樣品的吡哌酸ELISA法與HPLC法的比較。
[0045] 圖10為以雞蛋為樣品的吡哌酸ELISA法與HPLC法的比較。
[0046] 圖11為以雞肉為樣品的吡哌酸ELISA法與HPLC法的比較。
[0047] 圖12為以豬肉為樣品的吡哌酸ELISA法與HPLC法的比較。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試 劑、方法和設(shè)備。
[0049] 除非特別說(shuō)明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。
[0050] 實(shí)施例1吡哌酸免疫原的合成及鑒定 1、稱(chēng)取5. 2 mg的吡哌酸和20 mg的1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC)溶 于ImL加入20 μ L氫氧化鈉的磷酸鹽緩沖溶液中，記為A液；稱(chēng)取15 mg牛血清白蛋白 (BSA)溶于ImL磷酸鹽緩沖液中，記為B液；將A液加入B液中，，室溫?cái)嚢?0~40 min，將 反應(yīng)后溶液裝于透析袋，用磷酸鹽緩沖溶液于室溫透析3天，期間換透析液6次，即得到目 的產(chǎn)物吡哌酸-BSA (免疫原）。
[0051] 2、免疫原的鑒定 分別將吡哌酸、BSA、人工抗原，在紫外（200~400 nm)下掃描，發(fā)現(xiàn)人工抗原與BSAdft 哌酸相比，吸收曲線(如附圖1所示）有明顯變化，可以確定免疫原制備成功。
[0052] 實(shí)施例2吡哌酸包被原的合成及鑒定 1、大致方法與實(shí)施例1相同，但采用卵清蛋白（OVA)作載體蛋白，得到目的產(chǎn)物吡哌 酸-OVA (包被原)。
[0053] 2、包被原的鑒定 分別將吡哌酸、0VA、人工抗原，在紫外（200~400 nm)下掃描，發(fā)現(xiàn)人工抗原與OVAJtt： 哌酸相比，吸收曲線(如附圖1所示）有明顯變化，可以確定包被原制備成功。
[0054] 實(shí)施例3喹諾酮類(lèi)包被原的合成及鑒定 1、分別稱(chēng)取5. 2 mg的喹諾酮類(lèi)藥物(環(huán)丙沙星、帕珠沙星、加替沙星、洛美沙星、沙拉沙 星和格林沙星)分別溶于ImL磷酸鹽緩沖溶液中，并加入15mg卵清蛋白（0VA)。將1-(3-二 甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺加入上述溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20~40 min。將反應(yīng)后溶液 裝于透析袋，用磷酸鹽緩沖溶液于室溫透析3天，期間換透析液6次，即得到目的產(chǎn)物環(huán)丙 沙星-0VA、帕珠沙星-0VA、加替沙星-0VA、洛美沙星-0VA、沙拉沙星-OVA和格林沙星-0VA。
[0055] 2、包被原的鑒定 分別將喹諾酮類(lèi)、0VA、人工抗原，在紫外（200~400 nm)下掃描，發(fā)現(xiàn)人工抗原與0VA、 吡哌酸相比，吸收曲線（如附圖2~7所示）有明顯變化，可以確定喹諾酮類(lèi)包被原制備成 功。
[0056] 實(shí)施例4吡哌酸多克隆抗體的制備及鑒定 1、吡哌酸抗體的制備 本實(shí)施例選用2只7周齡、體重2公斤左右、健康的新西蘭大白兔，分別編號(hào)。實(shí)驗(yàn)免 疫劑量為〇. 5 mg/只，在兔背部皮下多點(diǎn)免疫，每三周加強(qiáng)免疫1次。初次免疫選用完全佐 劑與免疫原等體積混合乳化后免疫，加強(qiáng)免疫則選用不完全佐劑。
[0057] 2、吡哌酸抗體效價(jià)的測(cè)定 從第3次加強(qiáng)免疫開(kāi)始，每次第8天采血，經(jīng)放置、離心后得到血清，血清適當(dāng)稀釋后用 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定效價(jià)。四免后，兔子獲得高效價(jià)的抗體。免疫原1所獲得的抗體1 效價(jià)最高為1:128000,免疫原2所獲得的抗體2效價(jià)最高為1:64000?；诖?，選用抗體1 進(jìn)行免疫檢測(cè)方法的建立。
[0058] 實(shí)施例5吡哌酸抗體和包被原組合模式選擇及免疫檢測(cè)方法的建立 1、分別將吡哌酸抗體和7種包被原組合，采用方陣滴定法確定最優(yōu)包被原的種類(lèi)和工 作濃度，以及吡哌酸抗體稀釋倍數(shù)(如表1所示)。
[0059] 2、用不同濃度的吡哌酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液做實(shí)驗(yàn)溶液，其濃度如下：0. 0048 ng/mL、 0.038 ng/mL、0. 31 ng/mL、2.44 ng/mL、19.53 ng/mL、156. 25 ng/mL、1250 ng/mL、10000 ng/mL、采用3組平行實(shí)驗(yàn)（n=3)。
[0060] 3、間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法：將包被抗原用pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋到0.5 μ g/ mL包被酶標(biāo)板，100 μ L/孔，置于37 °C過(guò)夜；傾去孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液300 μ L，洗 滌2次，然后甩凈洗滌液；每孔加入120 μ L封閉液，37°C封閉3h，然后甩凈洗滌液，37°C烘 lh。從第一孔開(kāi)始依