糖類抗原19-9（ca19-9）定量測定試劑盒及其制備方法與檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)療器械生物類免疫體外診斷領(lǐng)域，主要涉及一種基于磁微粒分離化 學(xué)發(fā)光法定量檢測血液中糖類抗原CA19-9的試劑盒及其制備方法，以及應(yīng)用該試劑盒定 量檢測血液中糖類抗原CA19-9的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖類抗原 CA19-9 (Carbohydrate Antigenl9-9, CA19-9)，是目前臨床上非常有診 斷價值的一種腫瘤抗原。糖類抗原CA19-9是胰腺癌、膽囊癌、結(jié)腸癌和胃癌等相關(guān)的腫瘤 標(biāo)志物。多項研究表面，糖類抗原CA19-9在組織中的含量與疾病的發(fā)展階段具有相關(guān)性。
[0003] 在國內(nèi)，糖類抗原CA19-9檢測臨床上主要以國外進(jìn)口試劑和免疫組化試劑應(yīng)用 為主，國外進(jìn)口試劑價格非常昂貴，給患者帶來很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，不利于在基層普及。國產(chǎn) 糖類抗原CA19-9免疫化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒目前還較少，也僅停留在96孔微孔板式技術(shù)水 平上，該技術(shù)靈敏度較低、線性窄、特異性較差，不利于高通量的全自動檢測。
[0004] 因此，有待開發(fā)對糖類抗原CA19-9檢測靈敏度高與可靠性并能降低檢測成本的 檢測技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供一種新的可定量檢測糖類抗原 CA19-9的試劑盒，提高檢測靈敏度及可靠性，并降低成本，延長有效期。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0007] -方面，本發(fā)明提供了一種糖類抗原CA19-9定量測定試劑盒，該試劑盒包括 CA19-9校準(zhǔn)品、CA19-9質(zhì)控品、抗試劑、磁微粒試劑和發(fā)光底物。
[0008] 其中：
[0009] -、糖類抗原CA19-9校準(zhǔn)品、糖類抗原CA19-9質(zhì)控品的配制方法如下：
[0010] 用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液溶解糖類抗原CA19-9,配置糖類抗原CA19-9校準(zhǔn)品、糖類抗原 CA19-9校準(zhǔn)品，其中，所述校準(zhǔn)品緩沖液是通過在IL新生牛血清中加入0.0 lg~0. 05g的 四環(huán)素和0.1 g~0. 5g硫酸新霉素，溶解后經(jīng)過0. 22 μ m濾膜處理制備；
[0011] 二、抗試劑的制備方法如下：
[0012] (1)、抗試劑緩沖液的制備：
[0013] Tris :12. 12mg，四環(huán)素：0· Olg~0· 05g，綿羊血清：Ig~5g，新生牛血清3g~ l〇g，馬血清Ig~5g加入IL純化水中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙猓?br>[0014] (2)、異硫氰酸熒光素與糖類抗原CA19-9的偶聯(lián)，獲得異硫氰酸熒光素標(biāo)記的 CA 19-9包被抗體：
[0015] 首先用抗試劑緩沖液將異硫氰酸突光素配制成濃度為I. 0~5. Omg/mL的異硫氰 酸熒光素溶液，然后按照糖類抗原CA19-9抗體與異硫氰酸熒光素的質(zhì)量之比為1:1. 1，將 二者同時轉(zhuǎn)移到棕色玻璃瓶中，室溫下攪拌1~2小時，充分反應(yīng)后使用pH = 8~9的碳 酸氫鹽緩沖液進(jìn)行平衡，然后凝膠層析分離純化得到的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CA19-9包 被抗體；
[0016] (3)、堿性磷酸酶與糖類抗原CA19-9抗體的偶聯(lián)，獲得堿性磷酸酶標(biāo)記的CA19-9 標(biāo)記抗體：
[0017] 首先用抗試劑緩沖液將堿性磷酸酶配制成濃度為I. 0~5. Omg/mL的堿性磷酸酶 溶液，然后按照堿性磷酸酶與糖類抗原CA19-9的摩爾比為1:2~1:10的量將二者轉(zhuǎn)移至 棕色瓶中，室溫下攪拌4~5小時，充分反應(yīng)后使用pH = 8~9的碳酸氫鹽緩沖液平衡，然 后使用凝膠層析分離純化得到的堿性磷酸酶標(biāo)記的CA19-9標(biāo)記抗體；注意含有連接物的 試管的避光防護(hù)。
[0018] (4)、將步驟（2)中獲得的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的糖類抗原CA19-9包被抗體和和 步驟（3)中獲得的堿性磷酸酶標(biāo)記的糖類抗原CA19-9標(biāo)記抗體，加入含有表面活性劑的 Tris鹽緩沖液充，分?jǐn)嚢韬螳@得所述抗試劑；所述表面活性劑為Tween20、Triton X-100、 Bronidox中的一種或多種，表面活性劑的添加量為0. 01 %~0. 5%。
[0019] 本發(fā)明中，所述的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CA19-9包被抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的 CA19-9標(biāo)記抗體除能與糖類抗原19-9(CA19-9)抗原特異性結(jié)合外，配對使用時可與抗原 形成"三明治"夾心結(jié)構(gòu)。
[0020] 三、磁微粒試劑的制備：
[0021 ] 將抗異硫氰酸熒光素抗體與羧基磁珠偶聯(lián)制得磁微粒試劑。
[0022] (1)、取一定體積的充分混勻后的羧基磁珠濃縮液至反應(yīng)瓶中，將該反應(yīng)瓶在磁場 放置15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反應(yīng)瓶中加入2~5倍于反應(yīng)瓶中羧基磁 珠體積的磁微粒緩沖液，混勻20-30min。再將反應(yīng)瓶置于磁場中15min后吸去上清。重復(fù) 清洗羧基磁珠3遍。最后將羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混勻；
[0023] (2)、連接反應(yīng)：按照羧基磁珠與抗異硫氰酸熒光素抗體質(zhì)量比為100:1的比例， 在羧基磁珠中加入抗異硫氰酸熒光素抗體，2~8°C內(nèi)保持混勻狀態(tài)反應(yīng)18小時；
[0024] (3)、反應(yīng)瓶在在磁場放置15min，待羧基磁珠沉降后用磷酸緩沖液清洗3遍，然后 定容至10mg/mL，2~8°C保存，制得所需待用磁微粒試劑。
[0025] 四、發(fā)光底物的制備
[0026] 將ALPS溶解于發(fā)光底物緩沖液中制備發(fā)光底物。
[0027] 用4~10倍于ALPS體積的發(fā)光底物緩沖液充分溶解ALPS，所述發(fā)光底物緩沖液 的配置方法是：Trisl2. 12g~121. 14g，氯化鈉5. 82g，光澤精0. 3g，加入IL純化水中，充分 攪拌至完全溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)緩沖液的PH至9. 5。
[0028] 進(jìn)一步的，本發(fā)明的糖類抗原CA19-9定量測定試劑盒，該試劑盒還包括清洗液。 該清洗液主要用于在檢測過程中清洗與磁微粒試劑反應(yīng)后的樣品，清洗液的具體組分可以 參照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行。通常是磷酸二氫鈉、氯化納、Tween20和ProcLin300的混 合溶液，在試劑盒制品中可以濃縮清洗液的形式存在，檢測時適當(dāng)稀釋后使用。優(yōu)選的清洗 液的配置方法是：Trisl2. 12g，氯化鈉5. 82g，Tween-2050mL，曲拉通-100, 50mL，加入IL純 化水中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙狻?br>[0029] 另一方面，本發(fā)明提供了這種糖類抗原CA19-9定量測定試劑盒的制備方法，包括 以下步驟。
[0030] 分別配制CA19-9校準(zhǔn)品、糖類抗原CA19-9質(zhì)控品、抗試劑、磁微粒試劑、發(fā)光底 物；將CA19-9校準(zhǔn)品、糖類抗原CA19-9質(zhì)控品、抗試劑、磁微粒試劑、發(fā)光底物獨(dú)立地置于 包裝容器內(nèi)，得到糖類抗原CA19-9的定量測定試劑盒。
[0031] 再一方面，本發(fā)明提供了利用這種糖類抗原CA19-9定量測定試劑盒檢測糖類抗 原CA19-9的方法，該方法包括步驟：
[0032] (1)取三支試管分別加15 μ L糖類抗原CA19-9的校準(zhǔn)品、15 μ L糖類抗原CA19-9 的質(zhì)控品、15 μ L待測樣本；
[0033] (2)每一試管中加入60 μ L抗試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，置 37 °C下水浴15分鐘；
[0034] (3)每一試管中加入30 μ L磁微粒試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s， 置37 °C下水浴5分鐘；
[0035] (4)將三支試管在磁分離器上沉淀2分鐘，緩慢的倒轉(zhuǎn)試管和磁分離器，倒出上清 液，把倒轉(zhuǎn)的試管連同磁分離器一起放在濾紙上，用力拍擊磁分離器底部以除去粘在管壁 上的所有液滴；
[0036] (5)每支試管中加入300 μ L清洗液，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，混 勻后緩慢的倒轉(zhuǎn)試管和磁分離器，倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管連同磁分離器一起放在濾紙 上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
[0037] (6)重復(fù)步驟（5) -次；
[0038] (7)每一試管中加入200 μ L發(fā)光底物溶液，振蕩混勻3s，用化學(xué)發(fā)光儀檢測發(fā)光 強(qiáng)度。
[0039] 本發(fā)明的試劑盒中未詳細(xì)提及的試劑組分（例如清洗液、一些必要的緩沖液等）、 試劑盒的外包裝以及各試劑組分的獨(dú)立包裝容器等均可以按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行， 符合相關(guān)行業(yè)規(guī)定即可。本發(fā)明的方法中未詳細(xì)提及的操作步驟也可參照所屬領(lǐng)域的常規(guī) 操作進(jìn)行，例如，在檢測前，可將各試劑放至室溫（18~25°C )，加樣前充分混勻；所用檢測 儀器設(shè)備例如化學(xué)發(fā)光類測定儀的使用按照說明書操作進(jìn)行；
[0040] 本發(fā)明中，未特別注明單位的比例與含量，固體組分為質(zhì)量