利用磁性納米粒子的檢測(cè)測(cè)定法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于檢測(cè)靶分子的加速測(cè)定法。 現(xiàn)有技術(shù)
[0002] 被認(rèn)為作為背景與本發(fā)明所公開的主題相關(guān)的參考文獻(xiàn)列于下文中：
[0003] [l]W02011/030286
[0004] [2]US 2005/0032051
[0005] [3]W02011/045436
[0006] [4]EP 0339980
[0007] [5]W0 2011/155890
[0008] [6]US 7927561
[0009] [7]US 5736349
[0010] [8]US 5320944
[0011] [9]US 2003/0049864
[0012] [10]EP 0339623
[0013] [11]Urbach, A. R.等人，J. Am Chem. Soc. 2003, 125, 12704-12705
[0014] [12] Osman, 0·等人，15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (第15屆化學(xué)和生命科學(xué)小型化系統(tǒng)國(guó)際會(huì)議），2011 年10月2日-6日，美國(guó)華盛頓州的西雅圖（Seattle，Washington，USA)。在本文對(duì)上述參 考文獻(xiàn)的承認(rèn)不應(yīng)當(dāng)被推斷為意味著這些參考文獻(xiàn)以任何方式與本發(fā)明所公開的主題的 可專利性有關(guān)。
【背景技術(shù)】
[0015]
[0016] 測(cè)定法通常被用于檢測(cè)樣品中的靶分子以實(shí)現(xiàn)研究或診斷的目的。
[0017] US 7, 927, 561公開了在流體樣品中檢測(cè)分析物的方法。將所述流體樣品與涂有針 對(duì)所述分析物的結(jié)合分子的磁性粒子一起孵育。所述方法是基于使用聚焦磁體將磁性標(biāo)記 的分析物集中到檢測(cè)區(qū)。
[0018] WO 2011/045436公開了一種側(cè)流測(cè)定裝置和一種在液體樣品中檢測(cè)分析物的方 法。所述側(cè)流測(cè)定裝置包括樣品區(qū)和反應(yīng)區(qū)，所述反應(yīng)區(qū)形成樣品的流動(dòng)路徑。所述方法 利用帶有非磁性標(biāo)記的第一捕捉分子和帶有磁性粒子的第二捕捉分子。
[0019] WO 2011/030286公開了一種用于檢測(cè)樣品中的分析物的方法，所述方法包括 能夠與所述分析物結(jié)合的多種捕捉部分。這些捕捉部分中的至少一種與固體基質(zhì)結(jié)合 并且至少一種其它捕捉部分與可檢測(cè)的標(biāo)記物結(jié)合，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記物是具有 彡50nm- < 5, OOOnm的粒度的大粒子標(biāo)記物。這種測(cè)定法是以〃夾心測(cè)定法"的形式進(jìn)行 的，其中所述分析物被捕捉在兩種不同的捕捉分子之間。
[0020] 多種檢測(cè)測(cè)定法涉及將靶分子固定到多孔基質(zhì)（例如膜）上，繼而與靶標(biāo)結(jié)合劑 一起孵育（例如斑點(diǎn)印跡法或蛋白質(zhì)印跡法）。對(duì)革巴標(biāo)結(jié)合劑進(jìn)行標(biāo)記（直接或經(jīng)由二級(jí) 結(jié)合劑），因此在進(jìn)行合適的反應(yīng)時(shí)，形成信號(hào)，所述信號(hào)指示所述靶分子的存在以及它的 量。
[0021] 蛋白質(zhì)印跡的工作流程是長(zhǎng)時(shí)間的、繁重的并且常常從開始到結(jié)束要耗時(shí)超過(guò)一 天。在將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到印跡膜之后，進(jìn)行顯影過(guò)程，這個(gè)過(guò)程要耗時(shí)3-4小時(shí)到過(guò)夜才完 成。顯影過(guò)程包括膜封閉、抗體探測(cè)、反復(fù)的膜洗滌以及信號(hào)檢測(cè)；這是整個(gè)工作流程中最 繁重的部分。
[0022] 因此需要研發(fā)一種提高基于基質(zhì)的檢測(cè)方法的速度的測(cè)定法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023] 本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)：使靶標(biāo)結(jié)合劑（捕捉分子）與磁性納米粒子（MNP)，優(yōu)選 地與具有小直徑的磁性納米粒子締合并且在測(cè)定期間施加磁場(chǎng)在很大程度上提高了斑點(diǎn) 印跡、蛋白質(zhì)印跡以及ELISA分析測(cè)定法中檢測(cè)步驟的效率。
[0024] 使用具有相對(duì)小直徑的MNP對(duì)檢測(cè)測(cè)定法的速度和效率具有這樣的提高作用的 事實(shí)是驚人的。如以下實(shí)施例中所證實(shí)，在數(shù)分鐘內(nèi)獲得可靠的測(cè)定結(jié)果。
[0025] 不希望受理論所束縛，使用小的MNP相對(duì)于利用更大的MNP的現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定法的 所舉例說(shuō)明的優(yōu)勢(shì)可能起因于以下原因：
[0026] A. MNP的小尺寸允許所述粒子滲入到具有小孔隙的基質(zhì)中，從而允許與被固定在 所述基質(zhì)的孔隙內(nèi)的靶分子結(jié)合。因此，如斑點(diǎn)印跡法和蛋白質(zhì)印跡法的測(cè)定法的磁力加 速可以僅通過(guò)使用比這些測(cè)定法中常用的膜的平均孔徑小得多的小MNP而成為可能。
[0027] B.使用更大的MNP可能對(duì)測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍加以限制。使用大的MNP來(lái)檢測(cè)連接到 固體基質(zhì)的較小分子（甚至是大分子，如蛋白質(zhì)）可能會(huì)用MNP使基質(zhì)飽和并且從而干擾 測(cè)定動(dòng)力學(xué)。也就是說(shuō)，即使當(dāng)在基質(zhì)上存在少量的分子時(shí)，一個(gè)MNP仍將與超過(guò)一個(gè)分子 結(jié)合，并且因此檢測(cè)上限將是相對(duì)低的。相比之下，使用小MNP，例如與靶大分子具有相似尺 寸的MNP即使當(dāng)在基質(zhì)上存在大量的分子時(shí)仍將使得1:1的結(jié)合比成為可能，并且因此，將 獲得更高的動(dòng)態(tài)范圍。
[0028] C.小MNP的溶解性一般優(yōu)于大MNP，并且由于更少沉降在表面上而產(chǎn)生更好的測(cè) 定性能，例如就表面上的信號(hào)均勻度以及更低的背景而言。
[0029] 因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)靶分子的測(cè)定法，所述測(cè)定法包 括：
[0030] a.將潛在地包含至少一種靶分子的基質(zhì)與被可檢測(cè)地標(biāo)記的磁性納米粒子 (MNP)復(fù)合體一起孵育，其中所述MNP復(fù)合體包含具有小直徑的與捕捉分子締合的MNP，所 述捕捉分子能夠直接地或間接地與所述祀分子結(jié)合；
[0031] b.施加磁場(chǎng)；以及
[0032] c.對(duì)所述孵育過(guò)的基質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)步驟；
[0033] 借此檢測(cè)信號(hào)的存在指示所述靶分子的存在并且信號(hào)強(qiáng)度指示所述靶分子的量。
[0034] 在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)靶分子的測(cè)定法，所述測(cè)定法包括：
[0035] a.提供被可檢測(cè)地標(biāo)記的磁性納米粒子（MNP)復(fù)合體，其中所述MNP復(fù)合體包含 與二級(jí)結(jié)合劑締合的MNP，所述二級(jí)結(jié)合劑能夠結(jié)合一級(jí)結(jié)合劑；
[0036] b.將所述MNP復(fù)合體與一級(jí)結(jié)合劑一起孵育，從而形成第二MNP復(fù)合體，所述第二 MNP復(fù)合體包含MNP、二級(jí)結(jié)合劑、以及一級(jí)結(jié)合劑；
[0037] c.將潛在地包含至少一種靶分子的基質(zhì)與所述第二MNP復(fù)合體一起孵育；
[0038] d.施加磁場(chǎng)；以及
[0039] e.對(duì)所述孵育過(guò)的樣品進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)；
[0040] 借此檢測(cè)信號(hào)的存在指示所述靶分子的存在并且信號(hào)強(qiáng)度指示所述靶分子的量。
[0041] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種測(cè)定系統(tǒng)，所述測(cè)定系統(tǒng)包括潛在地包含至少 一種靶分子的基質(zhì)；至少一種被可檢測(cè)地標(biāo)記的MNP復(fù)合體，其中所述MNP復(fù)合體包含具 有小直徑的與捕捉分子締合的MNP，所述捕捉分子能夠直接地或間接地與所述靶分子結(jié)合； 以及至少一種磁體。
[0042] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種被可檢測(cè)地標(biāo)記的MNP復(fù)合體，所述復(fù)合體包 含具有小直徑的與捕捉分子締合的磁性納米粒子，所述捕捉分子能夠直接地或間接地與靶 分子結(jié)合，所述復(fù)合體用于檢測(cè)所述靶分子的測(cè)定法中，其中所述靶分子被固定到基質(zhì)上。 [0043] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是多孔基質(zhì)。所述多孔基質(zhì)可以是膜、過(guò)濾器或凝 膠。
[0044] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多孔基質(zhì)的平均孔徑大于MNP的平均直徑。
[0045] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是無(wú)孔基質(zhì)。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述捕捉分子是一級(jí)結(jié)合劑。
[0047] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述捕捉分子是二級(jí)結(jié)合劑。
[0048] 在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述基質(zhì)與一級(jí)結(jié)合劑一起孵育，之后與包含所述二級(jí)結(jié) 合劑的MNP復(fù)合體一起孵育。
[0049] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，將包含所述二級(jí)結(jié)合劑的MNP復(fù)合體與一級(jí)結(jié)合劑一起孵 育，之后與所述基質(zhì)一起孵育。
[0050] 在某些實(shí)施方案中，所述一級(jí)結(jié)合劑是一抗。
[0051 ] 在某個(gè)實(shí)施方案中，所述二級(jí)結(jié)合劑是二抗。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述MNP復(fù)合體中的MNP被可檢測(cè)地標(biāo)記。
[0053] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述MNP復(fù)合體中的捕捉分子被可檢測(cè)地標(biāo)記。
[0054] 標(biāo)記劑可以選自由以下各項(xiàng)組成的組：熒光化合物，如熒光素（或熒光素衍生物， 如FITC)或藻紅蛋白（PE);熒光粒子，如量子點(diǎn)；酶，如辣根過(guò)氧化物酶（HRP)或堿性磷酸 酶（AP);發(fā)色團(tuán)；或電化學(xué)活性分子或放射性分子。
[0055] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測(cè)步驟包括信號(hào)顯影反應(yīng)。
[0056] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述信號(hào)顯影反應(yīng)是化學(xué)發(fā)光反應(yīng)或比色反應(yīng)。
[0057] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述MNP具有小于50nm的直徑。
[0058] 在具體的實(shí)施方案中，所述MNP具有10nm、20nm、25nm或30nm的直徑。
[0059] 在某些實(shí)施方案中，所述測(cè)定法被用于斑點(diǎn)印跡分析、蛋白質(zhì)印跡分析、狹縫印跡 法、ELISA 或 RIA。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述磁場(chǎng)是由磁體陣列產(chǎn)生的，所述磁體陣列由呈棋盤式配 置的小磁體構(gòu)成。
[0061] 在某些實(shí)施方案中，在將所述基質(zhì)與所述MNP復(fù)合體一起孵育之前，使用封閉溶 液對(duì)所述基質(zhì)進(jìn)行封閉。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在將所述基質(zhì)與封閉溶液一起孵育之前，對(duì)所述基質(zhì)進(jìn)行干 燥步驟。
[0063] 所述干燥步驟可以通過(guò)加熱、空氣流動(dòng)、浸泡在極性有機(jī)溶劑中、真空或其任何組 合來(lái)執(zhí)行。
【附圖說(shuō)明】
[0064] 為了更好地理解本文所公開的主題以及為了舉例說(shuō)明如何可以在實(shí)踐中實(shí)施所 述主題，現(xiàn)將僅通過(guò)非限制性實(shí)例的方式，參考附圖來(lái)描述實(shí)施方案，其中：
[0065] 圖IA-C示出了容納具有三種不同直徑（20nm、IOOnm以及200nm)的MNP的小瓶：圖 IA示出了在施加磁場(chǎng)之前的小瓶，圖IB和IC示出了在施加強(qiáng)磁場(chǎng)（7300高斯的表面場(chǎng)）5 分鐘之后同一些小瓶。圖2是根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定法的示意圖。
[0066] 圖3是具有IOOnm的平均直徑的示例性MNP復(fù)合體的示意圖。
[0067] 圖4示出了與熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)捕捉分子鏈霉親和素-PE(藻紅蛋白）和抗 體-FITC (異硫氰酸熒光素）相比較，IOOnm MNP隨膜上斑點(diǎn)的量而變的熒光信號(hào)。
[0068] 圖5A-B示出了生物素化的蛋白質(zhì)的反應(yīng)的斑點(diǎn)印跡測(cè)定法：圖5A使用標(biāo)準(zhǔn)捕捉 分子鏈霉親和素-PE，檢測(cè)暴露時(shí)間：4秒，并且圖5B使用涂有鏈霉親和素的IOOnm MNP，檢 測(cè)暴露時(shí)間：15秒。
[0069] 圖6是示例性小MNP (平均直徑<50nm)的圖示。該圖示出了具有兩親性聚合物表 面涂層的水溶性IO納米粒子的圖示。
[0070] 圖7示出了在指示HRP催化的顏色形成的450nm波長(zhǎng)下隨以下各項(xiàng)的濃度而變 的光密度（OD)的圖表：抗兔IgG-HRP標(biāo)記的IOnm MNP、20nm MNP、30nm MNP、或游離抗兔 IgG-HRP0
[0071] 圖8示出了以不同的靶標(biāo)濃度使用游離抗兔IgG-HRP (上圖）和帶有抗兔IgG-HRP 的IOnm MNP(下圖）對(duì)兔IgG進(jìn)行的斑點(diǎn)印跡測(cè)定。
[0072] 圖9是使用游離抗體的測(cè)定法的示意圖。
[0073] 圖10示出了使用帶有抗兔IgG-HRP的20nm MNP (左圖）和游離抗兔IgG-HRP (右 圖）對(duì)人類轉(zhuǎn)鐵蛋白（hT)/兔抗hT抗體進(jìn)行的斑點(diǎn)印跡測(cè)定。
[0074] 圖IlA-C示出了示例性斑點(diǎn)印跡裝備：圖IlA是樣品膜上的實(shí)驗(yàn)設(shè)置的方案，圖 IlB是用于在磁場(chǎng)下進(jìn)行斑點(diǎn)印跡法的代表性裝置的俯視照片，圖IlC是該代表性裝置的 不同元件的照片：釹盤式磁體、膜、以及夾具。
[0075] 圖12示出了在施加磁場(chǎng)（左圖）和不施加磁場(chǎng)（右圖）的情況下使用以下各項(xiàng) 對(duì)兔IgG進(jìn)行的斑點(diǎn)印跡測(cè)定：IOnm MNP、20nm MNP、30nm MNP (全部均帶有抗兔IgG-HRP)、 以及游離抗兔IgG-HRP。
[0076] 圖13是使用分開的抗體結(jié)合步驟的測(cè)定法的示意圖。
[0077] 圖14是使用組合的抗體結(jié)合步驟的測(cè)定法的示意圖。在進(jìn)行該測(cè)定之前，例如在 電泳期間將連接有二抗和標(biāo)記的MNP與一抗一起預(yù)先孵育。
[0078] 圖15示出了使用分開的抗體結(jié)合步驟（上圖）和組合的抗體結(jié)合步驟（下圖） 對(duì)hT/兔抗hT抗體/MNP-抗兔抗體復(fù)合體進(jìn)行的斑點(diǎn)印跡測(cè)定，其中該測(cè)定在磁場(chǎng)存在下 持續(xù)5分鐘（左圖）、在不存在磁場(chǎng)的情況下持續(xù)5分鐘（中央圖）、或在不存在磁場(chǎng)的情 況下持續(xù)1小時(shí)（右圖）。
[0079] 圖16示出了用于蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)