中的磁性配置：大塊磁體和小磁體陣列。示出了 用于斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)的磁體以說(shuō)明尺寸比例。
[0080] 圖17示出了用于如實(shí)施例7和8中所述的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中的包括振蕩器在內(nèi) 的實(shí)驗(yàn)裝備。
[0081] 圖18A-D示出了如實(shí)施例7中所述的基于MNP的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)的Chemidoc MP 圖像。在這些實(shí)驗(yàn)中，免疫測(cè)定作為在磁場(chǎng)下的一個(gè)5分鐘步驟（A:hSA模型，暴露時(shí)間：2 秒，B :hT模型，暴露時(shí)間：3秒）以及參考測(cè)定 即標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（C :hSA模型，暴 露時(shí)間：2秒，D :hT模型，暴露時(shí)間：3秒）進(jìn)行。指出了用于所示圖像的暴露時(shí)間。
[0082] 圖19A-B示出了圖18中所示的圖像即隨抗原蛋白質(zhì)的量變化的信號(hào)的分析圖表 (A :hSA ;B :hT)。
[0083] 圖20A-D示出了如實(shí)施例8中所述的基于MNP的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)的Chemidoc MP 圖像。在這些實(shí)驗(yàn)中，免疫測(cè)定是作為在磁場(chǎng)下在進(jìn)行膜干燥的情況下（C:hSA模型，暴露 時(shí)間：3秒，D :hT模型，暴露時(shí)間：5秒），或在沒(méi)有進(jìn)行膜干燥的情況下（A :hSA模型，暴露 時(shí)間：7秒，B :hT模型，暴露時(shí)間：5秒）的一個(gè)5分鐘步驟而進(jìn)行的。指出了用于所示圖像 的暴露時(shí)間。
[0084] 圖21示出了圖20中所示的圖像，即隨抗原蛋白質(zhì)的量變化的SNR的分析圖表。
[0085] 圖22示出了如實(shí)施例9中所述的對(duì)hSA模型和hT模型這兩者進(jìn)行的基于MNP的 ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在這些實(shí)驗(yàn)中，免疫測(cè)定作為在磁場(chǎng)下的一個(gè)5分鐘步驟以及參考測(cè) 定 即標(biāo)準(zhǔn)ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。
【具體實(shí)施方式】
[0086] 本發(fā)明提供了一種具有提高的效率和速度的免疫測(cè)定法。本發(fā)明的免疫測(cè)定法利 用與捕捉分子（結(jié)合劑）締合的并且被可檢測(cè)地標(biāo)記的小尺寸的磁性納米粒子。該測(cè)定法 是通過(guò)使用磁體而加速的。
[0087] MNP的磁化率在很大程度上取決于它們的尺寸，小MNP具有更低的磁化率，如例如 圖1中所示。將具有三種不同直徑（20nm、IOOnm以及200nm)的MNP以相同的濃度（100 μ g/ ml)溶解在PBS緩沖液中并且放置在小瓶（圖1A)中，將這些小瓶在強(qiáng)磁體（7300高斯的 表面場(chǎng)）上放置5分鐘（圖1B)。如可以在圖IB和IC中清楚地看到，IOOnm MNP和200nm MNP被吸引到磁體上，而20nm MNP的溶液顏色仍在視覺(jué)上保持不變，也就是說(shuō)，這些小MNP 沒(méi)有被顯著地吸引到磁體上。因此，驚人的是，使用這些小MNP在5分鐘內(nèi)在相同的磁場(chǎng)下 提供了這樣有效的測(cè)定加速。
[0088] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的磁性納米粒子用于檢測(cè)被固定在多孔基質(zhì)上的分析 物或祀分子。
[0089] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的磁性納米粒子用于檢測(cè)被固定在無(wú)孔基質(zhì)上的分 析物或靶分子。
[0090] 基于基質(zhì)的檢測(cè)測(cè)定法的非限制性實(shí)例是斑點(diǎn)印跡法、狹縫印跡法、蛋白質(zhì)印跡 法以及ELISA分析。這些是用于檢測(cè)樣品中靶分子（通常是蛋白質(zhì)）的存在和量的常用測(cè) 定法。在斑點(diǎn)印跡測(cè)定法中，將假定包括靶分子的整個(gè)樣品原樣放置到多孔物質(zhì)（例如硝 化纖維素膜）上并且將該樣品內(nèi)的蛋白質(zhì)以斑點(diǎn)的形式固定在膜中。
[0091 ] 在蛋白質(zhì)印跡測(cè)定法中，首先使假定包括靶分子的樣品在分離凝膠上進(jìn)行電泳， 從而將蛋白質(zhì)彼此分離，并且根據(jù)它們的尺寸形成梯度。隨后，將分離的蛋白質(zhì)根據(jù)它們?cè)?凝膠中對(duì)應(yīng)的位置印跡到硝化纖維素膜上并且固定到膜上。
[0092] 在ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法）中，將假定包括靶分子的整個(gè)樣品原樣放置到無(wú) 孔物質(zhì)（例如標(biāo)準(zhǔn)96孔培養(yǎng)板的孔）上并且該樣品內(nèi)的蛋白質(zhì)涂覆孔的底部?；蛘?，可以 進(jìn)行夾心ELISA測(cè)定法。在這種情況下，將孔的底部預(yù)先涂覆以針對(duì)靶分子的特異性一抗。 因此，靶分子經(jīng)由與這些抗體特異性結(jié)合而被固定到表面上。
[0093] 隨后，通過(guò)常規(guī)地利用一抗和二抗的免疫測(cè)定法來(lái)評(píng)估靶分子的存在和量，其中 所述二抗被可檢測(cè)地標(biāo)記以檢測(cè)靶分子的存在和它的量。
[0094] 下文提供的實(shí)施例證實(shí)了通過(guò)使用本發(fā)明的磁性納米粒子使免疫反應(yīng)加速、縮短 了測(cè)定時(shí)間并且獲得更高的測(cè)定靈敏度。
[0095] 因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)靶分子的測(cè)定法，所述測(cè)定法包 括：
[0096] a.將潛在地包含至少一種靶分子的基質(zhì)與被可檢測(cè)地標(biāo)記的磁性納米粒子 (MNP)復(fù)合體一起孵育，其中所述MNP復(fù)合體包含具有小直徑的與捕捉分子締合的MNP，所 述捕捉分子能夠直接地或間接地與所述祀分子結(jié)合；
[0097] b.施加磁場(chǎng)；以及
[0098] c.對(duì)所述孵育過(guò)的基質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)步驟；借此檢測(cè)信號(hào)的存在指示所述靶分子的 存在并且信號(hào)強(qiáng)度指示所述靶分子的量。
[0099] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是多孔基質(zhì)，如膜、過(guò)濾器、凝膠、海綿或任何其它多 孔基質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多孔基質(zhì)的平均孔徑大于小MNP的平均直徑。
[0100] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是無(wú)孔基質(zhì)，如塑料或玻璃。
[0101] 展示所述測(cè)定法的一個(gè)實(shí)施方案的代表性方案描繪在圖13中。
[0102] 與MNP締合的捕捉分子可以是一級(jí)（靶標(biāo)）結(jié)合劑（例如一抗）或二級(jí)結(jié)合劑 (例如二抗）。與MNP締合的結(jié)合劑可以被可檢測(cè)地標(biāo)記。或者，MNP本身可以被可檢測(cè)地 記 D
[0103] 如果MNP與一級(jí)結(jié)合劑締合，那么所述測(cè)定法以單個(gè)步驟進(jìn)行，其中將所述MNP直 接與靶分子一起孵育。任選地，將所述靶分子固定在多孔物質(zhì)上。
[0104] 如果MNP與二級(jí)結(jié)合劑締合，那么可以在將靶分子與一級(jí)靶標(biāo)結(jié)合劑一起孵育之 后將它們添加到測(cè)定中?；蛘?，可以向容納靶分子的測(cè)定容器中同時(shí)添加靶標(biāo)（一級(jí)）結(jié) 合劑和與二級(jí)結(jié)合劑締合的磁性納米粒子，任選地在孵育一段時(shí)間之后。任選地，所述靶分 子被固定在多孔物質(zhì)上。
[0105] 被放置在多孔基質(zhì)下或測(cè)定容器下的磁體引起加速的結(jié)合反應(yīng)，如下文提供的實(shí) 施例中所證實(shí)。
[0106] 圖2以非限制性方式示意性地圖示了本發(fā)明的總體構(gòu)思。該圖圖示了本發(fā)明的測(cè) 定法的不同組分：與能夠識(shí)別靶蛋白的抗體締合的被可檢測(cè)地標(biāo)記的磁性納米粒子、含有 所述蛋白質(zhì)革巴標(biāo)的基質(zhì)以及磁體。經(jīng)由施加磁場(chǎng)使MNP與被固定在基質(zhì)上的革巴蛋白的結(jié)合 加速。
[0107] 該總體構(gòu)思可以應(yīng)用于其中分析物被固定在多孔基質(zhì)內(nèi)的任何測(cè)定法。非限制性 實(shí)例包括斑點(diǎn)印跡測(cè)定法和蛋白質(zhì)印跡分析。類似地，本發(fā)明可以應(yīng)用于其中分析物被直 接固定到無(wú)孔基質(zhì)上或經(jīng)由與被固定到所述無(wú)孔基質(zhì)上的特異性抗體結(jié)合而被固定到無(wú) 孔基質(zhì)上的任何測(cè)定法，例如在孔板中進(jìn)行的ELISA中。
[0108] 根據(jù)本發(fā)明，可以在不分開(kāi)步驟（i)使一級(jí)結(jié)合劑與靶分子結(jié)合和步驟（ii)使二 級(jí)結(jié)合劑與所述一級(jí)結(jié)合劑結(jié)合的情況下進(jìn)行所述檢測(cè)測(cè)定法。這種"組合步驟"測(cè)定法 是基于帶有二級(jí)結(jié)合劑的MNP與一級(jí)結(jié)合劑的預(yù)孵育，所述一級(jí)結(jié)合劑通常呈摩爾過(guò)量以 確保高效地形成帶有一級(jí)結(jié)合劑的MNP復(fù)合體。所述測(cè)定法進(jìn)一步基于MNP- -級(jí)結(jié)合劑 復(fù)合體與靶分子的提高的反應(yīng)速率，這是通過(guò)施加磁場(chǎng)來(lái)加速的。
[0109] 因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)靶分子的測(cè)定法，所述測(cè)定法包 括：
[0110] a.提供被可檢測(cè)地標(biāo)記的磁性納米粒子（MNP)復(fù)合體，其中所述MNP復(fù)合體包含 與二級(jí)結(jié)合劑締合的MNP，所述二級(jí)結(jié)合劑能夠結(jié)合一級(jí)結(jié)合劑；
[0111] b.將所述MNP復(fù)合體與一級(jí)結(jié)合劑一起孵育，從而形成第二MNP復(fù)合體，所述第二 MNP復(fù)合體包含MNP、二級(jí)結(jié)合劑、以及一級(jí)結(jié)合劑；
[0112] c.將潛在地包含至少一種靶分子的基質(zhì)或樣品與所述第二MNP復(fù)合體一起孵育；
[0113] d.施加磁場(chǎng)；以及
[0114] e.對(duì)所述孵育過(guò)的樣品進(jìn)行檢測(cè)步驟；
[0115] 借此檢測(cè)信號(hào)的存在指示所述靶分子的存在并且信號(hào)強(qiáng)度指示所述靶分子的量。
[0116] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述MNP具有小直徑。
[0117] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是多孔基質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多孔基質(zhì)的平 均孔徑大于小MNP的平均直徑。
[0118] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是無(wú)孔基質(zhì)。
[0119] 展示"組合步驟"測(cè)定法的一個(gè)實(shí)施方案的代表性方案描繪在圖14中。
[0120] 如本文所提到的術(shù)語(yǔ)"磁性納米粒子復(fù)合體（MNP復(fù)合體）"指的是包含與一個(gè)或 多個(gè)捕捉分子締合的一個(gè)或多個(gè)磁性納米粒子的復(fù)合體。本發(fā)明的MNP復(fù)合體被可檢測(cè)地 標(biāo)記。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"被可檢測(cè)地標(biāo)記的MNP復(fù)合體"指的是如下的MNP復(fù)合體，所述 MNP復(fù)合體與可以通過(guò)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)（酶促反應(yīng)或顯色反應(yīng)）或通過(guò)熒光激發(fā)來(lái)檢測(cè)的化合 物締合并且有助于對(duì)靶分子進(jìn)行可視化、定量或檢測(cè)。所述標(biāo)記化合物可以與MNP締合（例 如在MNP的磁殼周圍形成）或與捕捉分子締合或與這兩者締合。
[0121] 標(biāo)記的MNP的非限制性實(shí)例是具有親脂性熒光染料殼的MNP，所述殼在磁芯周圍 形成并且涂有多糖基質(zhì)。捕捉分子可以與多糖基質(zhì)締合（或嵌在所述多糖基質(zhì)內(nèi)）。
[0122] 標(biāo)記劑可以是熒光化合物，例如熒光素（或熒光素衍生物，如FITC)或藻紅蛋白 (PE);熒光粒子，如量子點(diǎn)；酶，如辣根過(guò)氧化物酶（HRP)或堿性磷酸酶（AP);發(fā)色團(tuán)；或電 化學(xué)活性分子或放射性分子。
[0123] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"締合"或"締合的"指的是任何物理力或化學(xué)力，如范德華力 (Van-der-Walls)、配位、共價(jià)、離子、靜電、偶極-偶極、或氫鍵締合（鍵合或相互作用）。所 述締合可以直接或間接（即包含一種或多種中間劑）發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，所述中間 劑是抗體、另外的蛋白質(zhì)、激素、配體或間隔物。舉例來(lái)說(shuō)，所述中間劑可以是鏈霉親和素、 生物素、免疫球蛋白結(jié)合蛋白（例如蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、蛋白質(zhì)A/G、蛋白質(zhì)L等）、DNA或 RNA分子、肽標(biāo)簽或它的螯合復(fù)合體（例如聚組氨酸標(biāo)簽或次氮基三乙酸的金屬絡(luò)合物，如 Ni-NTA)〇
[0124] 磁性納米粒子復(fù)合體可以呈干燥形式（例如粉末）或分散在介質(zhì)中。"介質(zhì)"根據(jù) 它最寬泛的定義是帶有所述復(fù)合體的任何材料或體積。在一些實(shí)施方案中，所述介質(zhì)可以 是液體、凝膠、或多孔材料。在一些實(shí)施方案中，所述介質(zhì)可以是水性或非水性液體。
[0125] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"捕捉分子"指的是直接地或間接地與靶分子結(jié)合的試劑。捕 捉分子可以是靶標(biāo)結(jié)合劑（也被稱為一級(jí)結(jié)合劑）并且因而，它直接與靶分子結(jié)合。所述 捕捉分子還可以是與一級(jí)結(jié)合劑結(jié)合的二級(jí)結(jié)合劑并且因而它間接地經(jīng)由一級(jí)結(jié)合劑與 革巴分子結(jié)合。
[0126] 捕捉劑的非限制性實(shí)例包括抗體、免疫球蛋白結(jié)合蛋白（例如蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、 蛋白質(zhì)A/G、蛋白質(zhì)L)、鏈霉親和素（與生物素和生物素標(biāo)記的化合物結(jié)合）、與互補(bǔ)DNA或 RNA鏈結(jié)合的DNA或RNA鏈、以及與特定的肽標(biāo)簽（例如聚組氨酸標(biāo)簽）結(jié)合的螯合復(fù)合體 (如 Ni-NTA)。
[0127] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"靶標(biāo)結(jié)合劑或一級(jí)結(jié)合劑"指的是特異性地與靶分子（分析 物）締合（結(jié)合）的試劑。在一些實(shí)施方案中，所述靶標(biāo)結(jié)合劑是針對(duì)靶抗原的一抗。
[0128] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"二級(jí)結(jié)合劑"指的是與靶標(biāo)結(jié)合劑（一級(jí)結(jié)合劑）結(jié)合的試 劑。
[0129] 在一些實(shí)施方案中，靶標(biāo)結(jié)合劑是特異性地結(jié)合靶分子的抗體并且二級(jí)結(jié)合劑是 結(jié)合一抗的二抗。一抗針對(duì)靶標(biāo)具有特異性并且可以是但不限于小鼠抗體、兔抗體、山羊抗 體等。二抗類型的選擇取決于一抗的類別（例如IgG或IgD)以及一抗的來(lái)源，例如如果一 抗是小鼠抗體，那么二抗將是抗小鼠抗體。二抗可以被可檢測(cè)地標(biāo)記。標(biāo)記的非限制性實(shí) 例包括酶（例如HRP或AP)、熒光化合物（例如熒光素或藻紅蛋白）、發(fā)色團(tuán)、或電化學(xué)活性 分子或放射性分子。
[0130] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"第二MNP復(fù)合體"指的是包含MNP、二級(jí)結(jié)合劑、以及一級(jí)結(jié)合 劑的復(fù)合體。這種復(fù)合體是通過(guò)將與二級(jí)結(jié)合劑締合的MNP復(fù)合體與一級(jí)結(jié)合劑一起孵育 而獲得的。"第二MNP復(fù)合體"然后可以被直接施用于靶分子上。
[0131] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"抗體"指的是IgG、IgM、IgD、以及IgA抗體。這個(gè)術(shù)語(yǔ)指的是 全抗體或包含抗原結(jié)合域的抗體片段，例如scFv、Fab、F(ab'） 2、雙特異性抗體、雙體抗體、 以及能夠結(jié)合靶分子的其它片段。所述定義包括多克隆抗體和單克隆抗體。
[0132] 根據(jù)本發(fā)明的"磁性納米粒子"涵蓋具有使用磁場(chǎng)所觀測(cè)到的磁性（響應(yīng)于所施 加的磁場(chǎng)）的任何納米粒子（或納米粒子材料）。所述磁性納米粒子可以是順磁性納米粒 子、鐵磁性納米粒子、亞鐵磁性納米粒子或超順磁性納米粒子。
[0133] 在一些實(shí)施方案中，所述磁性納米粒子由金屬構(gòu)成（或摻雜有金屬），如鐵（Fe)、 鎳（Ni