用于檢測(cè)胃癌相關(guān)代謝小分子的核磁共振模型及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及惡性腫瘤胃癌檢測(cè)領(lǐng)域，利用一種核磁共振模型及其制備、應(yīng)用方法，在體外對(duì)胃癌進(jìn)行的發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)，其準(zhǔn)確率為70.8%、敏感度為81.6%、特異度為60.0%。
【背景技術(shù)】
[0002]胃癌是我國(guó)發(fā)病率較尚的癌癥之一，胃癌病人多數(shù)無(wú)明顯癥狀，少數(shù)人有惡心、嘔吐或潰瘍類似病癥的上消化道疾病的癥狀。胃癌的發(fā)病具有地域性。研究發(fā)現(xiàn)，亞洲地區(qū)，如中國(guó)、日本、韓國(guó)等具有較高的發(fā)病率。其次，胃癌的發(fā)病原因較為復(fù)雜，目前，已經(jīng)報(bào)道的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的誘因與日常飲食因素、胃潰瘍疾病、胃息肉疾病以及幽門螺旋桿菌感染有關(guān)。根據(jù)最新的2012年的統(tǒng)計(jì)，我國(guó)胃癌發(fā)病率為3.314人/萬(wàn)人，死亡率為每萬(wàn)人
2.434人/萬(wàn)人，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于世界上其他國(guó)家(發(fā)病率為2.309人/萬(wàn)人，死亡率為1.639人/萬(wàn)人)，位居惡性腫瘤第2位。通過(guò)不斷的研究發(fā)現(xiàn)，提高胃癌診斷效果從而提高胃癌病人五年生存率的根本策略是對(duì)胃癌的診斷，達(dá)到早發(fā)現(xiàn)早治療的目的。對(duì)于胃癌的診斷，開展較好的國(guó)家，如日本，其胃癌診斷的比例已經(jīng)超過(guò)全部診斷胃癌病例的一半以上，而我國(guó)對(duì)于胃癌的診斷僅為全部胃癌診斷病例的5-15%。胃癌在診斷以后進(jìn)行治療，病患的五年生存率可以達(dá)到90%，原因超過(guò)進(jìn)展期胃癌的治療效果(五年生存率僅為16.6%)。目前，對(duì)于胃癌的診斷方法，主要集中在內(nèi)窺鏡手段、影像學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷。其中，影像學(xué)手段包括鋇餐造影、螺旋CT成像；分子生物學(xué)手段即使對(duì)與癌癥相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)的標(biāo)志物進(jìn)行篩查，例如，張力蛋白同源磷酸酶基因、survivin基因、Livin基因、CA72-4蛋白、CA19-9蛋白等。鋇餐造影、內(nèi)窺胃鏡的方法，對(duì)于胃癌的診斷準(zhǔn)確率較高，但是由于這些方法檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，對(duì)病人的在生理上造成一定的傷害；對(duì)與基因和蛋白質(zhì)標(biāo)志物的篩查，檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，需要大型的儀器，同時(shí)，診斷的準(zhǔn)確率仍然處于較低的水平，在我國(guó)的普及率相對(duì)較低。
[0003]腫瘤標(biāo)志物是由腫瘤細(xì)胞合成并且分泌到體液中的活性物質(zhì)，存在與組織液、血液、唾液、尿液等體液中。1978年，在國(guó)立癌癥研究所召開的“人類免疫及腫瘤免疫診斷會(huì)議”上，由美國(guó)學(xué)者Herberman首次提出腫瘤標(biāo)志物(Tumor marker, TM)這一概念。腫瘤標(biāo)志物是指在惡性腫瘤發(fā)生及增殖過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞自身的特殊性所表達(dá)并合成，最后分泌到細(xì)胞間及體液中的物質(zhì)，或者，病人由于對(duì)腫瘤出現(xiàn)各種不同的生理或病理反應(yīng)，從而自身正常細(xì)胞分泌到組織或體液中的物質(zhì)，如某些蛋白質(zhì)、小分子等等，統(tǒng)稱為腫瘤標(biāo)志物。使用腫瘤標(biāo)志物，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)對(duì)腫瘤的檢測(cè)，并在診斷過(guò)程中起到輔助作用。依據(jù)其產(chǎn)生原理，腫瘤標(biāo)志物分為兩類，一類是有腫瘤自身分泌的；另一類是腫瘤與機(jī)體相互作用產(chǎn)生的。按其產(chǎn)生原理，我們把能反映惡性演變各個(gè)階段中表型及基因型的特征或特性的物質(zhì)，均稱為腫瘤標(biāo)志物。代謝組學(xué)是1999年英國(guó)帝國(guó)理工大學(xué)Jeremy Nicholson教授提出的，定性定量的分析生物體內(nèi)代謝小分子物質(zhì)的研究方法。對(duì)胃癌的代謝組學(xué)的研究，可以發(fā)現(xiàn)與胃癌有關(guān)的代謝小分子物質(zhì)。通過(guò)胃癌的標(biāo)志性小分子代謝物，有利于胃癌的早發(fā)現(xiàn)，早治療，從而提高胃癌病人的生存質(zhì)量。較早關(guān)于胃癌代謝組學(xué)的研究是2009年發(fā)表于Cancer Res的文章，而后又有多篇文章對(duì)胃癌的代謝組學(xué)進(jìn)行闡述，通過(guò)對(duì)胃癌的研究，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了很多胃癌所導(dǎo)致的產(chǎn)生差異調(diào)節(jié)(包括上調(diào)和下調(diào))的代謝小分子物質(zhì)，例如:乳酸，蘋果酸，尿酸，棕櫚酸，丁酸，丙酸，嘧啶，甘油，絲氨酸，谷氨酸，鳥氨酸，脯氨酸等。
[0004]核磁共振波譜法(NuclearMagnetic Resonance Spectroscopy，縮寫為 NMR)，是對(duì)各種有機(jī)和無(wú)機(jī)物的成分、結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析的工具。其原理主要是:在強(qiáng)磁場(chǎng)中，某些元素的原子核和電子能量本身所具有的磁性，被分裂成兩個(gè)或兩個(gè)以上量子化的能級(jí)。吸收適當(dāng)頻率的電磁福射，可在所產(chǎn)生的磁誘導(dǎo)能級(jí)之間發(fā)生躍迀。在磁場(chǎng)中，這種帶核磁性的分子或原子核吸收從低能態(tài)向高能態(tài)躍迀的兩個(gè)能級(jí)差的能量，會(huì)產(chǎn)生共振譜，可用于測(cè)定分子中某些原子的數(shù)目、類型和相對(duì)位置。盡管核磁共振波譜法在腫瘤代謝物檢測(cè)中有所應(yīng)用，但是迄今為止尚未見通過(guò)核磁共振波譜法構(gòu)建的模型能夠用于胃癌檢測(cè)，且準(zhǔn)確率達(dá)到85%以上的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是為了克服已有對(duì)胃癌相關(guān)代謝小分子標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)的不足之處，提供一種用于檢測(cè)胃癌相關(guān)代謝小分子標(biāo)志物的核磁共振模型及其制備方法。
[0006]本發(fā)明的第一個(gè)發(fā)明目的是提供一種用于檢測(cè)胃癌相關(guān)代謝小分子標(biāo)志物的核磁共振模型，其特征在于利用核磁共振波譜儀測(cè)定胃癌患者和健康人血漿樣本的代謝小分子，并篩選出相應(yīng)的胃癌相關(guān)代謝小分子標(biāo)志物，其中所述的胃癌相關(guān)代謝小分子標(biāo)志物包括:beta-D-葡萄糖、乳酸、肌酸、肌酸酐、乙醇、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸和脯氨酸。
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)發(fā)明目的是提供一種上述用于檢測(cè)胃癌相關(guān)代謝小分子標(biāo)志物的核磁共振模型的制備方法，包括以下步驟:
[0008]步驟一:收集多例II/III期胃癌患者血漿和健康人的血漿分別作為病例組和對(duì)照組血漿樣本，進(jìn)行低溫冷凍備用；
[0009]步驟二:對(duì)所述血漿樣本進(jìn)行核磁共振波譜前預(yù)處理；
[0010]步驟三:對(duì)預(yù)處理過(guò)的兩組血漿樣本進(jìn)行核磁共振波譜檢測(cè)，并收集數(shù)據(jù)；
[0011]步驟四:對(duì)于核磁共振波譜檢測(cè)到的代謝小分子，使用百分比差異度(rov)進(jìn)行評(píng)估，找出百分比差異度得分最大的代謝小分子；
[0012]步驟五:步驟五:以百分比差異度得分最大的代謝小分子的濃度作為聚類分割值，所述聚類分割值具體為利用正常血漿樣本中該小分子濃度的均值，計(jì)算方法為將正常樣本中該小分子的濃度加和，并除以正常樣本的數(shù)目得到；因此，將全部樣本分為2個(gè)子類，命名為Ml子類和M2子類，并通過(guò)ROC曲線比較聚類前后的曲線線下面積；
[0013]步驟六:應(yīng)用Mann-Whitney U test檢驗(yàn)方法對(duì)所述Ml子類和所述M2子類中的代謝小分子進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，得到所述Ml子類中，在病例組和對(duì)照組中存在明顯差異的代謝小分子，以及得到所述M2子類中，在病例組和對(duì)照組中存在明顯差異的代謝小分子，其中一部分代謝小分子在病例組中表達(dá)量過(guò)高，而另一部分代謝小分子的表達(dá)量在病例組中過(guò)低；
[0014]步驟七:將所述Ml子類和所述M2子類中，在病例組和對(duì)照組中存在明顯差異的所述代謝小分子作為胃癌相關(guān)代謝小分子標(biāo)志物，建立用于胃癌相關(guān)代謝小分子標(biāo)志物檢測(cè)的核磁共振模型。
[0015]百分比差異度(rov)評(píng)估，以及百分比差異度得分最大的代謝小分子的濃度的石角定，詳見參考文獻(xiàn) 8 (Cheng, S.L., B.F.Lian, J.Liang, T.Shi, L.Xie, and Y.L.Zhao, Siteselectivity for protein tyrosine nitrat1n:1nsights from features of structureand topological network.Molecular B1systems, 2013.9(11):p.2860-2868.)0
[0016]在本發(fā)明的核磁共振模型中，步驟五中百分比差異度得分最大的代謝小分子是脯氨酸；步驟六中得到所述Ml子類中，在病例組和對(duì)照組中存在明顯差異的代謝小分子是beta-D-葡萄糖、肌酸酐、乙醇、組氨酸和脯氨酸；步驟六中得到所述M2子類中，在病例組和對(duì)照組中存在明顯差異的代謝小分子是乳酸、肌酸、肌酸酐、亮氨酸、纈氨酸和組氨酸；其中乳酸、乙醇、亮氨酸、脯氨酸都在病例組中表達(dá)量過(guò)高，而beta-D-葡萄糖、肌酸、肌酸酐、纈氨酸、組氨酸的表達(dá)量在病例組中過(guò)低；作為胃癌相關(guān)代謝小分子標(biāo)志物是beta-D-葡萄糖、乳酸、肌酸、肌酸酐、乙醇、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸和脯氨酸。
[0017]進(jìn)一步地，其中所述步驟一包括將從所述病例組和所述對(duì)照組取得的全血樣本離心，去血細(xì)胞，保留血漿，得到血漿樣本，進(jìn)行低溫凍存?zhèn)溆谩?br>[0018]進(jìn)一步地，其中所述步驟一還包括將得到的所述血漿樣本以I倍到5倍體積的生理鹽水稀釋低溫凍存?zhèn)溆谩?br>[0019]進(jìn)一步地，其中所述步驟二包括將所述血漿樣本與Na+/K+緩沖液混勻后離心取上清液，以備核磁共振波譜檢測(cè)用。
[0020]進(jìn)一步地，其中所述步驟三進(jìn)行核磁共振波譜檢測(cè)時(shí)的檢測(cè)條件是使用CPMG序列采集小分子信息，譜寬為15?25ppm，等待時(shí)間為I?3s，90°脈寬為10?12 μ s，采樣點(diǎn)數(shù)為28?34K，F(xiàn)ID累加次數(shù)為60?68次，回波演化時(shí)間為300?400us，回波循環(huán)為90?110，總回波時(shí)間為60?80ms。
[0021]在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，其中所述步驟三進(jìn)行核磁共振波譜檢測(cè)時(shí)的檢測(cè)條件是使用CPMG序列采集小分子信息，譜寬為20ppm，等待時(shí)間為2s，90°脈寬為11.6 μ S，采樣點(diǎn)數(shù)為32K，F(xiàn)ID累加次數(shù)為64次，回波演化時(shí)間為350us，回波循環(huán)為100，總回波時(shí)間為70ms ο
[0022]本發(fā)明的第三個(gè)發(fā)明目的是提供所述的代謝分子標(biāo)志物組成的核磁共振模型，或者上述方法所制備的核磁共振模型，在檢測(cè)胃癌中的應(yīng)用。其中，所述的應(yīng)用包括所述胃癌相關(guān)代謝小分子標(biāo)志物組成的核磁共振模型，在胃癌診斷或監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。
[0023]在一種所述的核磁共振模型的應(yīng)用中，使用最近鄰算法，所述最近鄰算法是對(duì)于每一