用于富集和分離具有的濃度在若干對數(shù)級上的細胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及磁性的流式細胞術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]在用于流式細胞術(shù)的目前已知方法中，借助于通道中的額外的液體流來使細胞集中在主通道的中心中并且因此被分離(鞘流原理)。此分離使得有可能在后續(xù)測量步驟中計數(shù)細胞(例如通過光學(xué)或阻抗滴定裝置)。通過磁性標記待定量的顆粒，有可能在實際定量之前從復(fù)雜樣本中分離和富集所述顆粒。
[0003]然而，為了維持此技術(shù)的功能性，需要產(chǎn)生鞘流的大量的額外液體。此方法還與具有例如稀釋步驟和離心步驟的進一步制備相關(guān)，這些制備也與污染風(fēng)險相關(guān)。稀釋步驟對于使計數(shù)率與細胞計數(shù)器的(即計數(shù)器的)磁傳感器的最小和最大計數(shù)率匹配而言是必要的。
[0004]待實現(xiàn)的目標在于提供一種裝置和一種方法，通過所述裝置和所述方法能夠更快速地且以更小的污染風(fēng)險進行細胞術(shù)測量，例如，確定細胞樣本的濃度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]此目標通過根據(jù)本申請權(quán)利要求1的根據(jù)本發(fā)明用于流式細胞術(shù)測量的裝置來實現(xiàn)。此外，所述目標通過根據(jù)申請權(quán)利要求10的根據(jù)本發(fā)明的方法來實現(xiàn)。本發(fā)明的有利改進由從屬權(quán)利要求詳細說明。
[0006]本發(fā)明是基于在閉合系統(tǒng)內(nèi)進行多個富集步驟的概念。這通過根據(jù)本發(fā)明的裝置的通道的結(jié)構(gòu)設(shè)計和通過使用所述通道中的偏轉(zhuǎn)裝置而變得可能的。本發(fā)明使能進行具有多于10的數(shù)次冪的濃度(例如10至10000個細胞/微升)的細胞的靶向富集和分離。特別地，本發(fā)明使得有可能能夠在單個測量過程中測量可能的多于10的多次冪的細胞濃度。即使在計數(shù)器的受限制的動態(tài)響應(yīng)的情況下，這也允許在復(fù)雜樣本內(nèi)的單個微流體通道中覆蓋較大的動態(tài)范圍，而無需先前稀釋、分離或富集步驟。
[0007]為此目的，根據(jù)本發(fā)明的用于流式細胞術(shù)測量的裝置包括室和通道，其中所述通道包括磁傳感器并且設(shè)置在所述室的下游。所述室和所述通道形成閉合系統(tǒng)，其中所通道的軸線沿著所述通道的流動方向延伸。如果所述室直接匯合至所述通道中，則存在閉合系統(tǒng)。所述裝置特征在于磁體，更具體地在于永磁體和偏轉(zhuǎn)裝置，所述磁體和所述偏轉(zhuǎn)裝置兩者均布置在所述通道的預(yù)定側(cè)處。在此，所述偏轉(zhuǎn)裝置具有至少一個區(qū)段。每個區(qū)段布置在通道的濃度區(qū)域中。每個區(qū)段具有用于引導(dǎo)細胞朝向軸線的裝置。偏轉(zhuǎn)裝置由此能夠?qū)崿F(xiàn)磁性標記細胞的富集，所述細胞通過各個濃度區(qū)域中的磁體被拉至通道的一側(cè)，至所述軸線上且這些細胞沿著所述軸線被引導(dǎo)至磁傳感器。
[0008]以上論述的目標同樣由根據(jù)本發(fā)明的用于富集對于流式細胞術(shù)的細胞樣本中待檢測的細胞類型的細胞的方法來實現(xiàn)。在此首先提供待檢測的細胞類型的磁性標記細胞。標記細胞被富集在根據(jù)本發(fā)明的裝置的實施例的通道中。為此目的，標記細胞借助于通道中的磁體被拉至所述通道的預(yù)定側(cè)上。在通道中的層流的情況下，那里的細胞中的至少一些通過偏轉(zhuǎn)裝置被引導(dǎo)至軸線，所述軸線沿所述通道的流動方向延伸，并且由此富集在所述軸線上。這使能實現(xiàn)細胞的有效富集。因此，即使復(fù)雜樣本(即含有許多不同細胞和其它顆粒(例如蛋白質(zhì))的未純化樣本)也能夠用于無中間步驟的流式細胞術(shù)，特別是以未稀釋的方式。
[0009]提供磁性標記細胞能夠包括標記所述細胞。在此，可使用兩種標記變型。
[0010]在第一種變型中，待檢測的細胞可在培養(yǎng)步驟中通過在裝置的室中混合和/或攪拌標記物(具體地，對于待檢測的細胞類型具有特異性的至少一種抗體，所述抗體連接至至少一種磁性標記物)和細胞樣本來進行標記。此變型優(yōu)選地在達14個細胞/微升的較小總細胞濃度的情況下使用。在這種情況下，布置在所述室的側(cè)上的磁體能夠有助于混合和/或攪拌過程。
[0011]在所述裝置的一個實施例中，磁體對應(yīng)地布置在所述室的預(yù)定側(cè)處，所述磁體有助于混合和/或攪拌過程。
[0012]在具有更大總細胞濃度(例如達16個細胞/微升)的細胞樣本的情況下，可替代地，有可能在通道中提供在制備期間對于待檢測的細胞類型具有特異性的至少一種抗體，所述抗體與至少一種磁性標記物相連接。當(dāng)使用布置在通道的一側(cè)上的磁體在所述通道中產(chǎn)生磁場時，抗體在所述通道的所述側(cè)處富集。緊接著，細胞樣本被引入至通道中，且由此使至少一種特異性抗體與細胞樣本的以層流方式流經(jīng)所述通道的所述側(cè)的那一部分相接觸。因此，在此部分中包含細胞的部分標記，而無需稀釋或純化步驟。因此，在層流系統(tǒng)中實現(xiàn)所需細胞的逐層標記?？商娲?，還能夠借助于設(shè)置在那里的磁體在室中進行此類部分標記。
[0013]因此，在流體流的情況下，僅一層(即細胞樣本的限定部分，例如所需細胞的1%)在閉合系統(tǒng)中被磁性標記。
[0014]偏轉(zhuǎn)裝置能夠具有一個或多個導(dǎo)向元件，其作為用于引導(dǎo)區(qū)段中的細胞的裝置，所述導(dǎo)向元件例如形成凹槽并且將標記細胞引導(dǎo)至軸線。在根據(jù)本發(fā)明的裝置的尤其有利的實施例中，偏轉(zhuǎn)裝置的至少一個區(qū)段包括布置成與軸線成角度的導(dǎo)向元件，其作為用于引導(dǎo)細胞的裝置。以一起或獨立的方式，所述導(dǎo)向元件形成在流動方向上漸縮的至少一個漏斗形狀。這使磁性標記細胞能偏轉(zhuǎn)至通道的軸線，且由此使能實現(xiàn)富集。
[0015]以示例的方式，如果它完全或部分地包括鐵磁性材料，則在裝置的另一實施例中至少一個導(dǎo)向元件能夠形成在流動方向上漸縮的V形，從而促進磁性標記細胞的磁泳導(dǎo)向。
[0016]額外地或者可替代地，所述導(dǎo)向元件中的至少兩個能夠配置成對于多個細胞的壁并且能夠布置成在流動方向上沿軸線偏置，且由此形成朝向所述軸線的機械引導(dǎo)，這是憑借形成對于細胞的運動路徑的邊界來實現(xiàn)的。
[0017]額外地，磁性腹板能夠沿通道的軸線布置，特別地設(shè)置在相同軸線水平處的兩個導(dǎo)向元件之間。因此，促進在通道的軸線上的磁性標記細胞的引導(dǎo)。
[0018]優(yōu)選地，通道的至少兩個濃度區(qū)域具有不同的構(gòu)型。細胞樣本能夠由此在多個對數(shù)級中富集。這樣能夠?qū)崿F(xiàn)的是能夠通過具有受限制的動態(tài)響應(yīng)的計數(shù)器來測量存在的富集。
[0019]以示例的方式，所述至少兩個濃度區(qū)域能夠在預(yù)定側(cè)與同所述預(yù)定側(cè)相對的一側(cè)之間的通道的預(yù)定高度方面有所不同。因此，在每個濃度區(qū)域中確定限定體積。不同濃度區(qū)域中的不同體積引起在偏轉(zhuǎn)元件中在富集之前通過通道的磁體進行細胞的第一富集，使得統(tǒng)計學(xué)上有意義的和限定的細胞數(shù)量在給定濃度下的每個富集步驟中是可調(diào)整的。
[0020]相比之下，通道寬度優(yōu)選地對于所有濃度區(qū)域是恒定的。在恒定通道寬度的情況下，額外地或可替代地，所述至少兩個濃度區(qū)域能夠在偏轉(zhuǎn)裝置的預(yù)定寬度(如垂直于軸線所測量的)和/或所述偏轉(zhuǎn)裝置沿通道的軸線的各個區(qū)段的長度方面有所不同。這些尺寸確定偏轉(zhuǎn)裝置的匯流面積，即影響富集的程度。
[0021]在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實施例中，借助于磁傳感器在偏轉(zhuǎn)裝置下游的軸線上進行細胞術(shù)，具體地細胞計數(shù)。使用這樣，有可能例如確定細胞樣本的濃度。
[0022]在這種情況下，借助于偏轉(zhuǎn)裝置下游的細胞術(shù)確定細胞樣本的濃度優(yōu)選地包括借助于磁傳感器對來自至少一個濃度區(qū)域且流經(jīng)軸線上的富集的細胞進行計數(shù)。針對至少一個濃度區(qū)域，從在計數(shù)富集的細胞時確立的濃度區(qū)域的計數(shù)值、濃度區(qū)域的體積以及濃度區(qū)域中的偏轉(zhuǎn)裝置的區(qū)段的寬度來確立細胞樣本的濃度。這是有效和節(jié)省時間的測量，其的評估是快速可用的。自然地，在此選擇至少濃度區(qū)域，針對所述濃度區(qū)域出現(xiàn)對于統(tǒng)計學(xué)相關(guān)陳述而言足夠大并且小于由計數(shù)器能夠可靠記錄的最大計數(shù)率的計數(shù)器值。
[0023]可能需要確立在給定時間當(dāng)前計數(shù)的細胞所屬的濃度區(qū)域。在所述方法的另一實施例中，針對其確立計數(shù)器值的各個濃度區(qū)域是基于磁傳感器的計數(shù)過程的已確立的時間來確立的。因此有可能引起時間間隔分配至校準裝置中的濃度區(qū)域。在某些情況下應(yīng)考慮流速。
【附圖說明】
[0024]下面，將基于附圖以具體的示例性實施例再一次更詳細地解釋本發(fā)明。在附圖中:
圖1示出根據(jù)本發(fā)明的裝置的實施例在截面中的簡圖，
圖2示出根據(jù)本發(fā)明的裝置的通道的簡圖，其中圖1A示出示意性的截面，且圖1B示出通道的示意性頂視圖，
圖3示出偏轉(zhuǎn)裝置的不同實施例的簡圖，其中圖3A示出具有機械導(dǎo)向件的偏轉(zhuǎn)裝置的透視圖，并且圖3B和圖3C示出具有磁泳導(dǎo)向件的偏轉(zhuǎn)裝置在每種情況下的示意性頂視圖，圖4示出在根據(jù)本發(fā)明的方法的實施例中緊接著引入細胞樣本之后(圖4A)和施加磁場之后(圖4B)通道中的細胞樣本的簡圖，
圖5示出闡明在根據(jù)本發(fā)明的方法的實施例中通道中的細胞的富集的簡圖，其中圖5A示出在一個時間點通道的頂視圖，且圖5B示出在不同時間偏轉(zhuǎn)裝置的區(qū)段的頂視圖，以及圖6示出其中在根據(jù)本發(fā)明的方法的實施例中測定細胞濃度以及在不同時間的通道的四個部段的簡圖。
【具體實施方式】
[0025]以下更詳細解釋的示例性實施例代表本發(fā)明的優(yōu)選實施例。在圖中，功能上等效的元件具有相同的附圖標記。圖中的坐標系K和K’幫助定向，其中豎直軸線“z”和與其垂直的水平軸線“X”簡化截面中的取向(圖1A)，并且其中水平軸線“X”和與水平軸線“X”和豎直軸線“z”垂直的軸線“y”簡化示例性通道14的頂視圖