肺炎鏈球菌Fam2PspA蛋白多克隆抗體IgG的免疫納米 磁珠作為固相載體，對(duì)應(yīng)的量子點(diǎn)標(biāo)記的鼠抗人肺炎鏈球菌Fam2PspA蛋白多克隆抗體IgG 作為檢測(cè)抗體，通過雙抗夾必法原理，建立人肺炎鏈球菌抗原的檢測(cè)體系，對(duì)相應(yīng)的檢測(cè)體 系中的捕獲條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述檢測(cè)體系中的最佳捕獲條件均與上述實(shí)驗(yàn)1及 實(shí)驗(yàn)2所給出的結(jié)果完全一致。
[0142] 實(shí)施例5PBST緩沖液的配制
[014引取8g NaCL，0. 2g KC1，0.24皿2口04,1. 44g胞2冊(cè)04,0.3g化噸，0. 5mlTween-20溶解 于800ml蒸傭水中，用5M化OH調(diào)整抑至7. 4,再定容至1000ml。
[0144] 實(shí)施例6質(zhì)控品的制備
[0145] 1.陽性質(zhì)控品；將用1 %甲醒滅活的人肺炎鏈球菌亞型菌株Sp6B(0. 5μg)干燥結(jié) 合到拭子上，即為陽性質(zhì)控品。
[0146] 2.陰性質(zhì)控品：陰性質(zhì)控品即經(jīng)臨床確定為人肺炎鏈球菌陰性的人群的咽拭子 樣品。
[0147] 實(shí)施例7試劑盒的制備
[0148] 由實(shí)施例2所描述的抗人肺炎鏈球菌免疫納米磁珠、實(shí)施例3所描述的量子點(diǎn)標(biāo) 記的抗人肺炎鏈球菌納米探針、實(shí)施例5所描述的PBST緩沖液、實(shí)施例6所描述的質(zhì)控品 共同組成基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人肺炎鏈球菌抗原的試劑盒。
[0149] 實(shí)施例8試劑盒的使用方法
[0150] 按常規(guī)臨床手段獲得人咽拭子，用0. 5ml試劑盒中的PBST緩沖液（8g/L化化， 0. 2g/LKC1，0. 24g/LKH2PO4,1. 44g/L胞2冊(cè)〇4,0. 5ml/LTween-20,抑7. 4)溶解咽拭子上的 臨床樣本后，將溶解液轉(zhuǎn)入1. 5ml普通離必管中，向該離必管中加入試劑盒中的抗人肺炎 鏈球菌免疫納米磁珠160μ1，室溫下W10巧m/min于旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)30min后取下，將離 必管插入磁力架分離3min，用移液器吸出上清。添加試劑盒中的PBST緩沖液1ml洗涂?jī)?遍，磁分離后吸出洗涂液，最后用ImLPBS緩沖液重懸磁珠。取100μ1上述的免疫納米磁 珠-鏈球菌抗原復(fù)合物于另一離必管中，再加入100μ1試劑盒中的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎 鏈球菌納米探針，室溫下W15巧m/min于旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)30min，通過量子點(diǎn)上的抗體與 免疫納米磁珠上的人肺炎鏈球菌抗原的免疫結(jié)合，量子點(diǎn)被標(biāo)記到肺炎鏈球菌表面，形成 磁珠-肺炎鏈球菌抗原-量子點(diǎn)"H明治"復(fù)合物。反應(yīng)完成后，磁分離3min，除去多余的 量子點(diǎn)標(biāo)記探針，并用PBST緩沖液清洗2遍，復(fù)合物重新分散在100μ1PBS緩沖液中，使 用英光酶標(biāo)儀巧X= 405皿，血=585nm)對(duì)其英光值進(jìn)行檢測(cè)。
[0151] 按上述同樣的方法檢測(cè)試劑盒中提供的四份陰性質(zhì)控品及一份陽性質(zhì)控品樣 品，分別讀取英光值；四份陰性質(zhì)控品樣品的英光讀數(shù)的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和即為 CUT-OFF值；若上述臨床人咽拭子樣本的檢測(cè)英光值若大于CUT-OFF值即判斷為此份臨床 咽拭子中人肺炎鏈球菌抗原為陽性，反之則判斷為此份臨床人咽拭子樣本中人肺炎鏈球菌 抗原為陰性；若陽性質(zhì)控品樣品的英光值小于CUT-OFF值，則表明試劑盒失效。
[0152] 實(shí)施例9試劑盒的檢測(cè)敏感性和特異性試驗(yàn)
[0153] 通過測(cè)定肺炎鏈球菌培養(yǎng)物稀釋液來做敏感性研究，確定實(shí)施例7所描述的基 于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人肺炎鏈球菌抗原的試劑盒檢測(cè)人肺炎鏈球菌亞型菌株 Sp她的檢測(cè)下限為2X103CFU/ml,而來自生產(chǎn)商Binax的名為BinaxNOWStr巧tococ州s pneumoniaetest(膠體金法）的試劑盒的檢測(cè)限為5Xl〇5CFU/ml，本發(fā)明試劑盒之檢測(cè)下 限較其明顯降低。另外，對(duì)臨床較為常見的分別具有FamlPspA及Fam2PspA的人肺炎鏈球 菌亞型菌株Spl9F及Sp23F的檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)施例7所述試劑盒對(duì)該兩亞型菌株的檢測(cè) 下限分別為 1Xl〇3CFU/ml及 5X103CFU/ml。
[0154] 用呼吸道常見病原體如人呼吸道合胞病毒化ong株，ATCC編號(hào)VR26)、人肺炎支原 體（ATCC編號(hào)15531)、人肺炎衣原體（AR-39株，ATCC編號(hào)53592)、人腺病毒3型（GB株， ATCC編號(hào)VR-3)、人腺病毒7型（Gomen株，ATCC編號(hào)VR-7)、人甲型流感病毒0ΠΝ1，ATCC 編號(hào)VR-1743)、人己型流感病毒（ATCC編號(hào)VR-790)、流感嗜血桿菌（ATCC編號(hào)53781)、卡 他莫拉菌（ATCC編號(hào)25238)等代替人肺炎鏈球菌進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒檢測(cè)含送些微生物的 PBST緩沖液都為陰性。
[0155] 實(shí)施例10臨床測(cè)試?yán)?br>[0156] W肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法-姨培養(yǎng)法作為參照，取150例呼吸科下呼吸道感染者 的肺泡灌洗液標(biāo)本用實(shí)施例7所描述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，培養(yǎng)法陽性率為12% (18/150)， 本試劑盒為13.3% (20/150)，2種方法的符合率為97. 3% (146/150)。兩種方法檢測(cè)結(jié)果 差異無顯著性。具體結(jié)果如表1所示。
[0157] 表1臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果 [015引
[0159] 需要指出的是，W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用W限制本發(fā)明，凡 在本發(fā)明精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換等均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人肺炎鏈球菌抗原的方法，其特征在于：所 述方法包括以下步驟： 1) 兔抗人肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體的制備； 2) 鼠抗人肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體的制備； 3) 將步驟1)制備的兔抗人肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體分別與 納米磁珠通過共價(jià)偶聯(lián)，分別制備抗人肺炎鏈球菌FamlPspA蛋白免疫納米磁珠及抗人肺 炎鏈球菌Fam2PspA蛋白免疫納米磁珠，將抗人肺炎鏈球菌FamlPspA蛋白免疫納米磁珠及 抗人肺炎鏈球菌Fam2PspA蛋白免疫納米磁珠等量混合即制得抗人肺炎鏈球菌免疫納米磁 珠； 4) 將步驟2)制備的鼠抗人肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體分別與 納米量子點(diǎn)通過共價(jià)偶聯(lián)，分別制備量子點(diǎn)標(biāo)記的人肺炎鏈球菌FamlPspA蛋白納米探針 以及量子點(diǎn)標(biāo)記的人肺炎鏈球菌Fam2PspA蛋白納米探針，將量子點(diǎn)標(biāo)記的人肺炎鏈球菌 FamlPspA蛋白納米探針以及量子點(diǎn)標(biāo)記的人肺炎鏈球菌Fam2PspA蛋白納米探針等量混合 即制得量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌納米探針； 5) 取人呼吸道分泌物樣本，用PBST緩沖液溶解后，加入步驟3)制備得到的抗人肺炎 鏈球菌免疫納米磁珠，充分混合，反應(yīng)15_45min后進(jìn)行磁分離，以PBST緩沖液洗滌2遍 后，向磁分離得到的沉淀物中加入步驟4)制備得到的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌納米 探針，反應(yīng)25-45min后進(jìn)行磁分離，以PBST緩沖液洗滌2遍后，使用熒光酶標(biāo)儀讀取熒光 值；所述PBST緩沖液中各組分含量分別為8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/ LNa2HP04,0. 5ml/LTween-20,所述PBST緩沖液的pH= 7· 4 ; 6) 根據(jù)步驟1)-步驟5)的方法分別檢測(cè)四份經(jīng)臨床確定為人肺炎鏈球菌陰性的人 群的呼吸道分泌物樣品，讀取熒光值；所述人肺炎鏈球菌陰性的人群的呼吸道分泌物樣品 簡(jiǎn)稱人肺炎鏈球菌陰性對(duì)照樣品；所述四份人肺炎鏈球菌陰性對(duì)照樣品的熒光值的平均值 與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和即為⑶T-OFF值；若步驟5)中人呼吸道分泌物樣本的檢測(cè)熒光值大于 CUT-OFF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人肺炎鏈球菌抗原為陽性；若步驟5)中人呼 吸道分泌物樣本的檢測(cè)熒光值小于⑶T-0FF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人肺炎鏈 球菌抗原為陰性。2. -種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人肺炎鏈球菌抗原的試劑盒，其特征在于： 所述基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人肺炎鏈球菌抗原的試劑盒由具有富集人肺炎鏈 球菌功能的抗人肺炎鏈球菌免疫納米磁珠、量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌納米探針、質(zhì)控 品以及PBST緩沖液所組成；所述質(zhì)控品包括陽性質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；所述陽性質(zhì)控品 由滅活的人肺炎鏈球菌干燥結(jié)合到拭子上而成；所述陰性質(zhì)控品是經(jīng)臨床確定為人肺炎鏈 球菌陰性的人群的咽拭子。3. -種用于制備如權(quán)利要求2所述的基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人肺炎鏈球 菌抗原的試劑盒的方法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟： 1)抗人肺炎鏈球菌免疫納米磁珠的制備： 1. 1)兔及鼠抗人肺炎鏈球菌FamlPSpA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體IgG的制備 1.L1)重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白的制備、純化： 1. 1. 1. 1)對(duì)人肺炎鏈球菌FamlPSpA、Fam2PspA蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分別獲取人 肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白胞外結(jié)構(gòu)域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對(duì)應(yīng) 的基因序列； 1. 1. 1. 2)在步驟1. 1. 1. 1)中所得到的基因序列的5'端及3'端分別引入酶切位點(diǎn)并 分別化學(xué)合成全基因序列，同時(shí)標(biāo)記記為PspAl、PspA2 ; 1. 1. 1. 3)將步驟1. 1. 1. 2)中所得到的PspAl、PspA2按分子生物學(xué)方法分別克隆入表 達(dá)載體pET-28a(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白；所述重組 PspAl-HiS、PSpA2-His融合蛋白均以可溶性表達(dá)形式存在于基因工程菌體中； 1. 1. 1. 4)用鎳柱純化步驟1. 1. 1. 3)所得到的重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)其純度后，再以Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整二種蛋白濃度均為0. 2mg/ mL后備用； 1. 1. 2)兔及鼠抗人肺炎鏈球菌FamlPSpA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體IgG的制備： 1.1.2.1)以步驟1.1.1.4)中所得到的重組？8?41-把8、？8?六2-把8融合蛋白為完全 抗原，分別免疫新西蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋 白抗血清及鼠抗重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白抗血清；所述兔抗重組PspAl-His、 PspA2-His融合蛋白抗血清及鼠抗重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白抗血清的間接 ELISA效價(jià)均大于IX105 ; 1. 1. 2. 2)采用用ProteinG親和層析柱分別純化兔抗重組PspAl-His、PspA2-His融 合蛋白抗血清及鼠抗重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白抗血清中的多克隆抗體IgG; 1. 1. 2. 3)用凱基Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定步驟1. 1. 2. 2)所得到的四種多 克隆抗體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調(diào)整為lmg/mL后備用，此四種多克隆抗體IgG即 分別為兔抗人肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體IgG及鼠抗人肺炎鏈球菌 FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體IgG; 1. 2)免疫納米磁珠的包被： 1. 2. 1)取5mg磁珠，用lmlMES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移 除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe304為內(nèi)核、粒徑為180