nm的羧基磁珠；所述MES緩沖液 是質(zhì)量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代）乙磺酸；所述MES緩沖液的pH= 6. 0 ;所述納米磁分 離器的磁性強(qiáng)度是0. 4T; 1. 2. 2)依次加入用步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是8-12mg/ml的EDC溶液 以及用步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-10mg/ml的sulfo-NHS溶液各0. 5ml， 以10-40rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化lhr，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清， 用lml步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠； 1. 2. 3)取5個離心管，在每個離心管中加入200μL步驟1. 2. 2)所得到的活化后的磁 珠，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的 濃度為50-200μg/ml的由步驟1. 1)所制備的兔抗人肺炎鏈球菌FamlPspA蛋白多克隆抗 體IgG溶液各lml,室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2-6h，置于納米磁分離器中進(jìn) 行磁分離后移除上清后，各加入lml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液，室溫下以15rpm/ min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2h以封閉磁珠上未與抗體反應(yīng)的羧基；所述PBS緩沖液中各成分 含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,所述PBS緩沖液的pH =7· 4 ; 1. 2. 4)封閉反應(yīng)完成后，將該5個離心管置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上 清，各用lml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0. 2g/L KC1，0. 24g/LΚΗ2Ρ04,1. 44g/LNa2HP04,0. 5ml/LTween-20,所述洗滌緩沖液的pH= 7· 4 ; 1.2.5) 向各個離心管中分別加入lml保存緩沖液重懸磁珠，置于4°C保存?zhèn)溆?；至此?得抗人肺炎鏈球菌FamlPspA蛋白免疫納米磁珠；所述保存緩沖液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04,0.3g/LNaN3,5g/L牛血清白蛋白，所述 保存緩沖液的pH= 7. 4 ; 1. 2. 6)按與步驟1. 2. 1)-1. 2. 5)相同的方法利用由步驟1. 1)所制備的兔抗人肺炎鏈 球菌Fam2PspA蛋白多克隆抗體IgG制得抗人肺炎鏈球菌Fam2PspA蛋白免疫納米磁珠；將 上述兩種免疫納米磁珠懸液按體積比1:1混合，即制得抗人肺炎鏈球菌免疫納米磁珠； 2) 量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌納米探針的制備： 其具體制備方法包括： 2. 1)向微量離心管中依次加入4nmol羧基水溶性量子點(diǎn)、600nmolN-羥基琥珀酰亞 胺sulfo-NHS以及600nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為5ml，混合溶液，37°C反應(yīng) 30min后，透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS及EDC，得到活化后的量子點(diǎn)；所述磷酸 鹽緩沖液中各成分含量如下：2. 9g/L磷酸氫二鈉，0. 295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉；所述 磷酸鹽緩沖液的pH= 7. 4 ; 2. 2)在步驟2. 1)所得到的活化的量子點(diǎn)中，加入8-16nmol的步驟1. 1)中所制備的 鼠抗人肺炎鏈球菌FamlPspA蛋白多克隆抗體IgG，避光反應(yīng)2h，加入單端氨基化聚乙二醇 PEG2000-NH2至終濃度為1%，封閉未反應(yīng)的活化羧基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng)lh; 2.3)用0.2μπιPES濾器過濾除去步驟2. 2)中的抗體聚集物，然后將濾液轉(zhuǎn)移到 50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的抗體和 反應(yīng)中的副產(chǎn)物； 2. 4)收集步驟2. 3)中超濾離心管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于2ml磷酸 鹽洗滌液中，再將此溶液轉(zhuǎn)移到一個新的50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下 離心15min，收集超濾離心管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于lml磷酸鹽保存液中， 置于4°C保存?zhèn)溆?，至此制得量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌FamlPspA蛋白納米探針；所述 磷酸鹽洗滌液中各成分含量如下：2. 9g/L磷酸氫二鈉，0. 295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉， 5ml/L吐溫-20,0. 3g/L疊氮鈉，所述磷酸鹽洗滌液的pH= 7. 4 ;所述磷酸鹽保存液中各成 分含量如下：2. 9g/L磷酸氫二鈉，0. 295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L牛血清白蛋白， 0. 3g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽保存液的pH= 7. 4 ; 2.5) 按與步驟2. 1)-2.4)相同的方法利用由步驟1.1)所制備的鼠抗人肺炎鏈球菌 Fam2PspA蛋白多克隆抗體IgG制得量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌Fam2PspA蛋白納米探針； 將上述兩種量子點(diǎn)標(biāo)記的納米探針溶液按體積比1:1混合，即制得抗人肺炎鏈球菌納米探 針； 3)PBST緩沖液的配制： 其具體配制方法包括： 取 8gNaCL，0.2gKCl，0.24KH2P04，1.44gNa2HP04,0.3gNaN3,0.5mlTween-20 溶解于 800ml蒸餾水中，用5MNaOH調(diào)整pH至L4,再定容至1000ml; 4)質(zhì)控品的制備： 4. 1陽性質(zhì)控品：陽性質(zhì)控品由滅活的人肺炎鏈球菌干燥結(jié)合到拭子上而成； 4. 2陰性質(zhì)控品：陰性質(zhì)控品即經(jīng)臨床確定為人肺炎鏈球菌陰性的人群的咽拭子。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟1.2. 2)中，依次加入用步驟 1. 2. 1)中的MES緩沖液配制的濃度是10mg/ml的EDC溶液以及用步驟1. 2. 1)中的MES緩 沖液配制的濃度是8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0. 5ml，以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化 lhr，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，用lml步驟1. 2. 1)中的MES緩沖液重 懸，得到活化后的磁珠； 所述步驟1. 2. 3)中，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度為100μg/ml的由步 驟1. 1)所制備的兔抗人肺炎鏈球菌FamlPspA蛋白蛋白多克隆抗體IgG溶液各lml,室溫下 以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)3h，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清后，各 加入lml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液； 所述步驟2. 2)中，在步驟2. 1)所得到的活化的量子點(diǎn)中，加入12nmol的步驟1. 1)中 所制備的鼠抗人肺炎鏈球菌FamlPspA蛋白多克隆抗體IgG，避光反應(yīng)2h。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述量子點(diǎn)是羧基化兩親聚合物修飾的 水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述磁珠是以超順磁性Fe304為內(nèi)核、殼 材料為聚苯乙烯、表面官能團(tuán)為羧基、粒徑為180nm的羧基磁珠。7. -種基于如權(quán)利要求2所述的基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人肺炎鏈球菌抗 原的試劑盒的使用方法，其特征在于：所述使用方法包括以下步驟： 1) 將待檢樣本用〇. 5mlPBST緩沖液溶解后將溶解液轉(zhuǎn)入1. 5ml普通離心管中；所述 PBST緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，1.44g/LNa2HP04， 0· 3g/LNaN3,0. 5ml/LTween-20 ;所述PBST緩沖液的pH= 7. 4 ; 2) 向步驟1)中的離心管中加入基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人肺炎鏈球菌抗原 的試劑盒中的抗人肺炎鏈球菌免疫納米磁珠60-200μ1，室溫下以10rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合 儀上反應(yīng)15-45min后取下，將離心管插入納米磁分離器磁分離3min，用移液器吸出上清； 3) 添加試劑盒中的PBST緩沖液lml洗滌兩遍，采用納米磁分離器磁分離后吸出洗滌 液，最后用lmlPBS緩沖液重懸磁珠，制得免疫納米磁珠-鏈球菌抗原復(fù)合物；所述PBS緩 沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH2P04，L44g/LNa2HP04;所述 PBS緩沖液的pH= 7· 4 ; 4) 取100μ1步驟3)得到的免疫納米磁珠-鏈球菌抗原復(fù)合物于另一離心管中，再加 入100μ1基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人肺炎鏈球菌抗原的試劑盒中的量子點(diǎn)標(biāo)記 的抗人肺炎鏈球菌納米探針，室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)25-45min，通過量 子點(diǎn)上的抗體與免疫納米磁珠上的鏈球菌抗原的免疫結(jié)合，量子點(diǎn)被標(biāo)記到鏈球菌抗原表 面，形成磁珠-鏈球菌抗原-量子點(diǎn)"三明治"復(fù)合物； 5) 反應(yīng)完成后，采用納米磁分離器磁分離3min，除去多余的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈 球菌納米探針，用試劑盒中的PBST緩沖液液清洗2遍，復(fù)合物重新分散在100μ1PBS緩 沖液中，使用熒光酶標(biāo)儀對其熒光值進(jìn)行檢測；所述PBS緩沖液中各成分含量如下：8g/L NaCL，0. 2g/LKC1，0. 24g/LΚΗ2Ρ04,1. 44g/LNa2HP04 ;所述PBS緩沖液的pH= 7. 4 ; 6)按上述同樣的方法檢測試劑盒中提供的四份陰性質(zhì)控品樣品及一份陽性質(zhì)控品 樣品，分別讀取熒光值；四份陰性質(zhì)控品樣品的熒光讀數(shù)的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和即為 CUT-OFF值；若步驟5)中待檢樣本的檢測熒光值若大于CUT-OFF值即判斷為待檢樣本中人 肺炎鏈球菌抗原為陽性，反之則判斷為待檢樣本中人肺炎鏈球菌抗原為陰性；若陽性質(zhì)控 品樣品的熒光值小于CUT-OFF值，則表明試劑盒失效。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述步驟2)中，向步驟1)中的離心管中 加入基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人肺炎鏈球菌抗原的試劑盒中的抗人肺炎鏈球菌 免疫納米磁珠160μ1，室溫下以10rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)30min后取下，將離心管插 入磁力架分離3min，用移液器吸出上清； 所述步驟4)中，取100μΙ步驟3)多得到的免疫納米磁珠-鏈球菌抗原復(fù)合物于另 一離心管中，再加入100μ1基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人肺炎鏈球菌抗原的試劑 盒中的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌納米探針，室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng) 30min,通過量子點(diǎn)上的抗體與免疫納米磁珠上的人肺炎鏈球菌抗原的免疫結(jié)合，量子點(diǎn)被 標(biāo)記到人肺炎鏈球菌抗原表面，形成磁珠-鏈球菌抗原-量子點(diǎn)"三明治"復(fù)合物。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：所述待檢樣本包括但不限于咽拭子。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測人肺炎鏈球菌抗原的快速檢測方法及試劑盒，其中，該試劑盒由具有富集人肺炎鏈球菌功能的抗人肺炎鏈球菌免疫納米磁珠、量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌納米探針、質(zhì)控品以及PBST緩沖液所組成；質(zhì)控品包括陽性質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；陽性質(zhì)控品由滅活的人肺炎鏈球菌干燥結(jié)合到拭子上而成；陰性質(zhì)控品是經(jīng)臨床確定為人肺炎鏈球菌陰性的人群的咽拭子。本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的能簡便、快速、高靈敏度的檢測人肺炎鏈球菌抗原的檢測方法和試劑盒，以及該試劑盒的制備及使用方法。
【IPC分類】G01N33/533, G01N33/68, G01N33/531
【公開號】CN105277713
【申請?zhí)枴緾N201410405100
【發(fā)明人】胡征, 楊波, 董俊
【申請人】董俊
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2014年8月18日