用于檢測rsv的免疫層析裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及特異性識別呼吸道合胞體病毒巧SV)的F蛋白的抗體和特異性識別N 蛋白的抗體被固定化的免疫層析裝置、W及含有該裝置從而形成的RSV的檢測用試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] RSV是呼吸道感染癥的致病病毒，并且在W下方面具有特征：被病毒感染的細胞 形成多核巨細胞（合胞體）。RSV與年齡無關(guān)，是在一生中都會引起感染的病毒，但特別是 在嬰幼兒時期，是成為引起非常嚴重的癥狀的原因的病原體。出生后1年W內(nèi)50~70%W 上的嬰兒感染該病毒，到3歲為止，幾乎全部的幼兒獲得了抗體，而出生后數(shù)周至數(shù)月的期 間內(nèi)的感染最會引起嚴重的癥狀。對出生體重低的嬰兒或免疫不健全、有屯、肺類基礎(chǔ)疾病 的幼兒而言，病情嚴重化的風險進一步提高。據(jù)報道由RSV感染引起的致死率為1~3%， 但根據(jù)不同情況有相當?shù)牟町悾⑶覔?jù)1980年代報道，在對屯、臟有基礎(chǔ)疾病的幼兒的住院 例的研究中，致死率達37 %。
[0003] RSV感染癥在世界各地均有報道，并且未見地理的、氣候的差異。特征在于，在任意 區(qū)域中，幼弱的嬰幼兒均會重癥化，并且尤其是在都市中每年均會反復流行。
[0004] 據(jù)報道，RSV感染癥約占嬰幼兒肺炎誘因的50%，占毛細支氣管炎誘因的50~ 90%。由肺炎、毛細支氣管炎等下呼吸道疾病而導致的幼兒的住院數(shù)與其說是與流感，不如 說是與RSV感染癥的流行高峰相一致。據(jù)觀察流行期內(nèi)年長兒童和成人中RSV的再次感染 是普遍的，但與嬰幼兒中的重癥化相比，年長兒童和成人中多數(shù)情況較輕，僅呈現(xiàn)輕度的感 冒樣癥狀。
[0005] 已知RSV在環(huán)境下較不穩(wěn)定，而在家庭中會高效地感染傳播。將病毒帶入家庭內(nèi) 的多數(shù)是表現(xiàn)出輕度癥狀的學齡兒童，有報道說有學齡兒童和嬰幼兒的家庭中，在流行期， 44%的家庭內(nèi)經(jīng)歷了RSV的感染傳播。作為感染的途徑，主要是大的呼吸道飛沫、W及通過 被來自呼吸道的分泌物污染的手指或物品的接觸，尤其經(jīng)由密切接觸而發(fā)生。因此，為了預 防嬰幼兒的感染，極為重要的是，其家庭正確把握有無RSV感染（無論癥狀的程度），并在確 認感染的情況下，避免與嬰幼兒接觸，并防止分泌物污染。
[0006] 從RSV感染、特別是對嬰幼兒感染的預防和治療的觀點來看，人們期望簡便且靈 敏度更高的迅速診斷試劑盒。對于感染了RSV的嬰幼兒，希望盡可能在早期開始適當?shù)闹?療，因此需要一方面在短時間內(nèi)能得到檢查結(jié)果、另一方面即使在感染初期病毒量很少的 時期也不會成為假陰性的高靈敏度的檢測試劑盒。另外，在嬰幼兒的家人表現(xiàn)出感冒癥狀、 疑似RSV感染的情況下，需要檢查有無RSV感染且對身體和經(jīng)濟負擔小的簡易檢查方法。
[0007] 作為滿足運樣要求的簡便且高靈敏度的迅速診斷試劑盒，開發(fā)了利用免疫層析法 的RSV檢測試劑盒。目前，已知多種可用于檢測病毒抗原并輔助診斷RSV感染癥的利用免 疫層析法的檢測試劑盒，但那些試劑盒均使用針對RSV的F蛋白的抗體（專利文獻1~3)。
[0008] RSV的F蛋白是存在于RSV表面的2種主要的糖蛋白中的一種。病毒表面除F蛋 白W外還存在G蛋白，G蛋白在RSV亞型A和B之間的同源性只有53%左右，與此相對，F(xiàn) 蛋白良好地保持在亞型之間和亞型內(nèi)。Beeler和Coelin曲（1989)的研究表明針對RSV的F蛋白的抗體能與1956~1985年間在美國或澳大利亞的各地分離的全部14種臨床分離株 結(jié)合，并證實了F蛋白非常高度地保存在病毒株之間（專利文獻4、非專利文獻1)。
[0009] 通過高度地保存抗原決定基應該能夠無遺漏地檢測全部臨床分離株，為此，在用 于檢測RSV的試劑盒中使用了針對F蛋白的抗體。然而，在使用通常的RSV檢測試劑盒進行 RSV檢測的情況下，存在用其他的檢查方法為陽性的樣本的30~40%被判定為陰性的大問 題。作為利用免疫層析法的檢測試劑盒判定假陰性的較多的原因，據(jù)認為可能是試劑盒所 使用的針對F蛋白的抗體的結(jié)合親和性不足，結(jié)果樣本中所含病毒量較少時得不到明確的 陽性信號而判定為假陰性。因此，為了開發(fā)即使病毒量小也能檢測到明確信號的高靈敏度 檢測試劑盒，嘗試制作了對RSV的F蛋白具有高親和性的單克隆抗體（專利文獻5)。然而， 僅通過提高針對F蛋白的抗體的親和性，開發(fā)能夠無遺漏地檢測臨床分離株運樣的表現(xiàn)出 足W實用的陽性檢測率的RSV檢測試劑盒是非常困難的。
[0010] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0011] 專利文獻
[0012] 專利文獻1 :日本專利特開2008-14751號公報
[0013] 專利文獻2 :日本專利特開2008-122372號公報
[0014] 專利文獻3 :日本專利特開2008-164403號公報
[0015] 專利文獻4 :日本專利特表2004-534513號公報
[0016] 專利文獻5 :日本專利特開2010-25745號公報
[0017] 非專利文獻 陽0化]非專利文獻 1JournalOfVirology,化Iy1989,Vol. 63,No. 7,P.2941-2950
【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 發(fā)明要解決的問題
[0020]本發(fā)明提供一種使用了在層析介質(zhì)的判定部位上與RSV的F蛋白特異性結(jié)合的抗 體、RSV的簡便且靈敏度更高的免疫層析裝置和利用免疫層析法的檢測用試劑盒，W及使用 了它們的RSV的檢測方法和判定或診斷RSV感染癥的方法。
[0021] 另外，本發(fā)明提供即使在樣本中所含病毒量很少的情況下也能高效檢測RSV的免 疫層析裝置和利用免疫層析法的檢測用試劑盒，W及使用了它們的RSV的檢測方法和判定 或診斷RSV感染癥的方法。 陽02引解決問題的方案
[0023] 本發(fā)明的發(fā)明人為了在判定部位上高效捕獲樣本中所含的RSV從而提高免疫層 析裝置的靈敏度，除了使更高親和性的針對F蛋白的抗體在判定部位上固定化W外，還研 究了將針對F蛋白的抗體與針對RSV的其他蛋白的抗體組合固定化。而且，本發(fā)明的發(fā)明 人發(fā)現(xiàn)，令人驚訝的是，與使針對F蛋白的抗體單獨固定化的檢測試劑盒相比，通過不僅使 針對F蛋白的抗體固定化、而且使其與針對RSV的N蛋白（核蛋白）的抗體組合固定化，可 W增強陽性樣本測定時的信號。本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過使與F蛋白結(jié)合的抗體和與N 蛋白結(jié)合的抗體組合固定化在判定部位上，即使是雖然通過PCR法等確認到充分的病毒量 存在，但在通常的免疫層析法中判定為陰性的樣本，也能正確地判定為陽性，并且能夠顯著 改善與其他檢查方法的陽性一致率。
[0024]目P，本發(fā)明設(shè)及一種免疫層析裝置，其特征在于，該免疫層析裝置包括運樣的層析 介質(zhì)作為構(gòu)成要素而構(gòu)成，其中在該層析介質(zhì)中，與F蛋白特異性結(jié)合的抗體和與N蛋白特 異性結(jié)合的抗體固定化于判定部位。
[00巧]另外，本發(fā)明設(shè)及含有上述免疫層析裝置而形成的RSV的檢測用試劑盒。
[00%] 本發(fā)明還設(shè)及RSV檢測方法，其使用在判定部位上固定化有與F蛋白特異性結(jié)合 的抗體和與N蛋白特異性結(jié)合的抗體的免疫層析裝置。另外，本發(fā)明設(shè)及利用免疫層析法 的RSV檢測率的改善方法，該方法包括使在判定部位固定化的針對F蛋白的抗體和針對N 蛋白的抗體與樣本液接觸的步驟。
[0027] 進一步如W下（1)~（12)來詳細說明本發(fā)明的實施方案。
[0028] (1) 一種免疫層析裝置，其含有運樣的層析介質(zhì)而構(gòu)成，該層析介質(zhì)具有固定化有 與RSV的F蛋白特異性結(jié)合的抗體和與RSV的N蛋白特異性結(jié)合的抗體的判定部位。
[0029] 似根據(jù)上述（1)所述的免疫層析裝置，其實質(zhì)上由試樣添加部、層析介質(zhì)和吸收 部構(gòu)成。
[0030] (3)根據(jù)上述（2)所述的免疫層析裝置，其還含有標記試劑保持部。
[003U (4)根據(jù)上述（1)~（3)中所述的免疫層析裝置，其中與F蛋白特異性結(jié)合的抗體 是與亞群A和亞群B各自的RSV株的F蛋白中的任一者或者運二者特異性結(jié)合的抗體。
[0032] (5) -種利用免疫層析法的RSV檢測用試劑盒，其含有免疫層析裝置和樣本稀釋 液，該免疫層析裝置含有運樣的層析介質(zhì)而構(gòu)成，該層析介質(zhì)具有固定化有與RSV的F蛋白 特異性結(jié)合的抗體和與RSV的N蛋白特異性結(jié)合的抗體的判定部位。
[0033] (6)根據(jù)上述（5)所述的檢測用試劑盒，其中免疫層析裝置實質(zhì)上由試樣添加部、 層析介質(zhì)和吸收部構(gòu)成。
[0034] (7)根據(jù)上述（6)所述的檢測用試劑盒，其中免疫層析裝置還含有標記試劑保持 部。
[0035] (8)根據(jù)上述（6)所述的檢測用試劑盒，其中檢測用試劑盒還含有標記試劑溶液。
[0036] (9) 一種RSV的檢測方法，其使用免疫層析裝置，該免疫層析裝置具有固定化有與 RSV的F蛋白特異性結(jié)