AuOMC的免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種基于Cr3+@Au@0MC的免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。具體是采用Cr3+@Au@0MC作為檢測(cè)抗體標(biāo)記物，制備一種夾心型電化學(xué)免疫傳感器，屬于新型功能材料、免疫分析以及生物傳感檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]人類受眾多病毒的干擾，比如麻疹和傳染性肝炎等，發(fā)病率高、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移速度快，對(duì)人類的健康有極大的危害。免疫球蛋白是人體血清中含量最高的抗感染抗體，約占血清免疫蛋白的70%?80%。人免疫球蛋白是人體受抗原(比如病毒)刺激后產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，主要功能是與抗原起免疫反應(yīng)，從而阻斷抗原(比如病毒產(chǎn)生抗原)對(duì)人體的危害。隨著人體內(nèi)與麻疹和傳染性肝炎相應(yīng)的抗原的產(chǎn)生，人體內(nèi)的免疫球蛋白的量也相應(yīng)增加。所以，人體內(nèi)免疫球蛋白含量的高低可以作為慢性感染、慢性肝病、免疫性疾病等疾病的參考值。因此在臨床研究上，發(fā)展快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)人免疫球蛋白的方法十分重要。
[0003]目前已有的對(duì)于人免疫球蛋白的檢測(cè)方法很多，如放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶標(biāo)記免疫分析法、化學(xué)免疫發(fā)光分析法、時(shí)間分辨熒光免疫分析法等，但多數(shù)檢測(cè)方法繁瑣，操作復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，檢出限高，因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)方法有重要意義。
[0004]免疫傳感器是將免疫學(xué)方法與分析化學(xué)方法相結(jié)合的一種生物傳感器，通過(guò)抗原與抗體之間的特異性結(jié)合，使得它具有靈敏度高、選擇性好、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、易于小型化、可連續(xù)、快速自動(dòng)化檢測(cè)分析等優(yōu)點(diǎn)。而構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器的關(guān)鍵有兩點(diǎn):其一是采用簡(jiǎn)單、快速、有效的方法將抗原抗體等生物分子固定在電極表面;其二是開發(fā)傳感器的信號(hào)放大技術(shù)。
[0005]電沉積金具有良好的導(dǎo)電性能，其優(yōu)良的生物相容性使之能夠很好的固載抗體，有序介孔碳以其大的比表面積能夠很好的固載金納米粒子和鉻離子，使之具有良好的催化性能，能夠加速電子傳遞，對(duì)于提高傳感器靈敏度具有重要作用。
[0006]因此本發(fā)明制備了一種應(yīng)用電沉積金作為基底材料和以Cr3+@Au@0MC為標(biāo)記物的免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)人免疫球蛋白的超靈敏檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的之一是基于Cr3+@Au@0MC作為檢測(cè)抗體標(biāo)記物，構(gòu)建了一種快速超靈敏的夾心型電化學(xué)免疫傳感器。
[0008]本發(fā)明的目的之二是將該夾心型電化學(xué)免疫傳感器應(yīng)用于人免疫球蛋白的檢測(cè)。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
1.一種基于Cr3+@Au@0MC的免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下:
(1)將直徑為3?5mm的玻碳電極用A1203拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將HAuCU(1 wt%)用計(jì)時(shí)電流法從-0.2V~0.2V電沉積到電極表面，晾干，用超純水沖洗，瞭干；
(3)滴涂6tiL、8?12 ug/mL的人免疫球蛋白捕獲抗體Ah溶液于電極表面，4°C冰箱中干燥；
(4)超純水沖洗掉未結(jié)合的捕獲抗體六匕后，滴加3yU0.l?1.0 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液于電極表面，4°C冰箱中晾干；
(5)超純水沖洗掉未結(jié)合的BSA后，滴加6yUlXlO—5?100 ng/mL的一系列不同濃度的人免疫球蛋白溶液，室溫孵化lh，超純水清洗，置于4°C冰箱中干燥；
(6)將6仙、1?3mg/mL的檢測(cè)抗體孵化物Cr3+@Au@OMC-Ab2溶液滴涂于電極表面上，室溫孵化lh，超純水清洗干凈，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于Cr3+@Au@0MC的人免疫球蛋白傳感器。
[0010]2.如權(quán)利要求1所述的一種基于Cr3+@Au@0MC的免疫傳感器的制備方法，所述的所述Cr3+@Au@0MC _Ab2二抗孵化物溶液的制備，其特征在于，制備步驟如下:
(1)金納米粒子溶液的制備
將1.0 mL氯金酸(1 wt%)加入到99 mL超純水中，邊攪拌邊加入2.5 mL的檸檬酸鈉(1wt%)，在100 °(:下回流15 min，離心分離，棄去沉淀，分散均勾的酒紅色的上清液即為金納米粒子溶液；
(2)Au@0MC的制備
準(zhǔn)確稱取10?20 mg的0MC加入離心管中，向離心管中加入卜2 mL超純水使其分散均勾，再將50 mL金納米粒子溶液加入離心管中，超聲10 min，放在振蕩器上振蕩24 h，離心分離，并用超純水洗滌，直至上清液無(wú)色，35°C真空干燥，制得黑色粉末AuOOMC;
(3)Cr3+@Au@0MC的制備
首先配置1 mg/mL的硝酸鉻溶液，然后準(zhǔn)確稱取4?6 mg的AuOOMC并加入4 mL的硝酸鉻溶液，超聲10 min，然后將其震蕩24 h，離心分離，并用超純水洗滌，直至上清液無(wú)色，35°C真空干燥，制得Cr3+@Au@0MC ；
(4)檢測(cè)抗體孵化物Cr3+@Au@OMC-Ab2溶液的制備
在2 mL、2?4 mg/mL的Cr3+@Au@0MC溶液中，加入2 mL的8?12 mg/mL的人免疫球蛋白檢測(cè)抗體Ab2溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12 h;離心分離后，加入1 mL 50 mmol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，得到檢測(cè)抗體孵化物Cr3+@Au@OMC-Ab2溶液，4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0011]3.如權(quán)利要求1所述的制備方法制備的一種基于Cr3+@Au@OMC-Ab2的免疫傳感器用于人免疫球蛋白的檢測(cè)，步驟如下:
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測(cè)試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.59- 8.02磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試；
(2)用計(jì)時(shí)電流法對(duì)人免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)，輸入電壓為-0.4V，取樣間隔0.1 s，運(yùn)行時(shí)間400 s；
(3)當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中加入10μL、5 mo 1 /L的雙氧水溶液，記錄電流變化。
[0012]4.如權(quán)利要求1所述的一種基于Cr3+@Au@0MC的免疫傳感器的制備方法，所述人免疫球蛋白選自下列之一:IgG和IgM。
[0013]本發(fā)明的有益成果
(1)本發(fā)明的發(fā)明人首次將Cr3+@AU@0MC納米粒子作為檢測(cè)抗體標(biāo)記物引入到人免疫球蛋白的電化學(xué)免疫傳感器的制備當(dāng)中，利用Cr3+@Au@0MC優(yōu)異的生物相容性和高的催化性能，使所制作的傳感器具有高的靈敏度和寬的檢測(cè)范圍，檢測(cè)IgG線性范圍為0.01 pg/mL?100 ng/mL，檢測(cè)限為0.003 pg/mL;檢測(cè)IgM的線性范圍為0.02pg/mL ~ 90 ng/mL，檢測(cè)限為0.004 pg/mLο
[0014](2)使用了具有良好催化效果電沉積金作為基底材料，既能夠很好的固載捕獲抗體，又可以提高比表面積和電子轉(zhuǎn)移速率，實(shí)現(xiàn)了電化學(xué)信號(hào)的放大，進(jìn)一步提高了傳感器的靈敏度。
[0015](3)使用完全相同的納米材料和修飾方法，利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，只需改變免疫球蛋白種類即可實(shí)現(xiàn)不同免疫球蛋白的高靈敏、特異性檢測(cè)，此方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大量樣品的測(cè)定，有利于免疫傳感器的商品化。
[0016](4)將Cr3+@Au@0MC納米粒子與人免疫球蛋白檢測(cè)抗體直接孵化，在檢測(cè)抗體的標(biāo)記物中不必使用酶，避免了因酶的失活和泄漏造成的檢測(cè)誤差，簡(jiǎn)化了檢測(cè)抗體標(biāo)記物的制作步驟，顯著提高了電化學(xué)免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0017]現(xiàn)將本發(fā)明通過(guò)【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步說(shuō)明，但不限于此
實(shí)施例1.一種基于Cr3+@Au@0MC的免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下:
(1)將直徑為3mm的玻碳電極用A1203拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將HAuCl4(1 wt%)用計(jì)時(shí)電流法從-0.2V電沉積到電極表面，晾干，用超純水沖洗，晾干；
(3)滴涂6燦、8ug/mL的人免疫球蛋白捕獲抗體Ah溶液于電極表面，4°C冰箱中干燥；
(4)超純水沖洗掉未結(jié)合的捕獲抗體六匕后，滴加3yU0.l mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液于電極表面，4°C冰箱中晾干；
(5)超純水沖洗掉未結(jié)合的BSA后，滴加6yUlXlO—5?100 ng/mL的一系列不同濃度的人免疫球蛋白溶液，室溫孵化lh，超純水清洗，置于4°C冰箱中干燥；
(6)將6汕、1mg/mL的檢測(cè)抗體孵化物Cr3+@Au@OMC-Ab2溶液滴涂于電極表面上，室溫孵化lh，超純水清洗干凈，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于Cr3+@Au@0MC的人免疫球蛋白傳感器。
[0018]實(shí)施例2.—種基于Cr3+@Au@0MC的免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下:
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用A1203拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將HAuCl4(1 wt%)用計(jì)時(shí)電流法從0 V電沉積到電極表面，晾干，用超純水沖洗，晾干；
(3)滴涂6pL.lO ug/mL的人免疫球蛋白捕獲抗體Ah溶液于電極表面，4°C冰箱中干燥；
(4)超純水沖洗掉未結(jié)合的捕獲抗體六匕后，滴加3yU0.5 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液于電極表面，4°C冰箱中晾干；
(5)超純水沖洗掉未結(jié)合的BSA后，滴加6yUlXlO—5?100 ng/mL的一系列不同濃度的人免疫球蛋白溶液，室溫孵化lh，超純水清洗，置于4°C冰箱中干燥；
(6)將6uL、2 mg/mL的檢測(cè)抗體孵化物Cr3+@Au@OMC-Ab2溶液滴涂于電極表面上，室溫孵化lh，超純水清洗干凈，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于Cr3+@Au@0MC的人免疫球蛋白傳感器。
[0019]實(shí)施例3.—種基于Cr3+@Au@0MC的免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下:
(1)將直徑為5mm的玻碳電極用A1203拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將HAuCl4(1 wt%)用計(jì)時(shí)電流法從0.2V電沉積到電極表面，晾干，用超純水沖洗，晾干；
(3)滴涂6tiL、12 ug/mL的人免疫球蛋白捕獲抗體Ah溶液于電極表面，4°C冰箱中干燥；
(4)超純水沖洗掉未結(jié)合的捕獲抗體六匕后，滴加3pLU.0 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液于電極表面，4°C冰箱中晾干；
(5)超純水沖洗掉未結(jié)合的BSA后