一種甲狀腺球蛋白(tg)測試試劑盒及其測試方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及測定血清的試劑盒及其測試方法，尤其是涉及測定血清中甲狀腺球蛋 白含量的試劑盒及其測試方法。
【背景技術】
[0002] 甲狀腺球蛋白（!^^呢1〇13111111，了6)，是甲狀腺濾泡上皮分泌的6601〇1糖蛋白，每個 TG約有2個甲狀腺素(T4)和0.5個三碘甲腺原氨酸(T3)分子，儲存在濾泡腔中。溶酶體水解 TG表面T4、T3并使之釋放入血，同時少量的TG也釋放入血，部分TG經甲狀腺淋巴管分泌入 血。血循環(huán)中的TG被肝臟的巨噬細胞清除。血清TG的改變較多見于甲狀腺部位的惡性腫瘤， 如TG在甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺乳頭狀癌和間變癌都可出現不同程度的升高；而甲狀腺髓 樣癌血TG可正?；蚪档?。前者主要是因為甲狀腺的破壞以及腫瘤組織分泌一定量的TG，而 致血中TG升高；后者的腫瘤組織來源于甲狀腺C細胞，而非甲狀腺上皮細胞，故其血清TG并 不升高。甲狀腺功能亢進癥、甲狀腺瘤、亞急性甲狀腺炎以及慢性淋巴細胞性甲狀腺炎等甲 狀腺疾病都可出現血中TG水平升高。從檢測的角度上來說，目前臨床上用于測定TG的方法 主要放免法、ELI SA法、化學發(fā)光法等。
[0003] 過去以放免為代表的甲狀腺球蛋白（TG)測定試劑盒受方法學的限制，其靈敏度和 抗干擾能力嚴重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市場;酶聯免疫法(ELISA)作為定性 檢測的方法，抗原、抗體的結合反應是在固相(ELISA板反應孔)表面進行的，其靈敏度、特異 性均較好，且經濟實惠，所以是應用得最廣、最多的方法?；瘜W發(fā)光法其靈敏度高，從化學角 度和自動化程度看，化學發(fā)光法優(yōu)于酶聯免疫法。這些方法雖然都有很多優(yōu)點，但在檢測的 靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、檢測用時等方面還有待進一步提尚。

【發(fā)明內容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術問題是克服上述現有技術的不足，提供一種特 異性強，靈敏度高，獲得檢測結果的時間短，操作方式簡便，檢測結果穩(wěn)定可靠的甲狀腺球 蛋白（TG)的測試試劑盒及其測試方法。
[0005] 為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：
[0006] -種甲狀腺球蛋白測試試劑盒，該試劑盒由磁分離試劑，試劑心，試劑R2，標準品， 質控品，校準品，清洗濃縮液，稀釋液及發(fā)光底物組成，其中：磁分離試劑:標記有小鼠抗人 TG的單克隆抗體的納米磁性微球，所述標記有小鼠抗人TG的單克隆抗體的納米磁性微球濃 度為167μg/ml;試劑心:含有堿性磷酸酶標記的TG抗體，所述堿性磷酸酶標記的TG抗體的濃 度為0.3μg/ml;試劑R2:含有牛y球蛋白質組分的緩沖液;標準品，質控品和fe準品：含有一 定量TG抗原的小牛血清溶液，所述標準品的濃度為0 (SO)、2 (S1)、10 (S2)、100 (S3)、250 (S4)、500 (S5 )ng/ml，所述質控品濃度為6，250ng/ml，所述校準品濃度為10，250ng/ml;清洗 濃縮液:含有Tween-20和Procl in-300的緩沖液;稀釋液:含有小牛血清的溶液;發(fā)光底物： 金剛烷的衍生物IUMIPH0S530,所述金剛烷的衍生物IUMIPH0S530的濃度為10μg/ml ;
[0007] -種甲狀腺球蛋白測試試劑盒，由下述體積分數組成的：磁分離試劑4%_6%，試 劑心6 % -8 %，試劑R26 % -8 %，標準品4 % -6 %，質控品1 % -3 %，校準品2 % -4 %，清洗濃縮液 15%-30%，稀釋液 10%-25%，發(fā)光底物25%-40%。
[0008] 優(yōu)選地，所述試劑盒由下述體積分數組成:磁分離試劑4 %，試劑%，試劑R26 %， 標準品4%，質控品1 %，校準品4%，清洗濃縮液15%，稀釋液25%，發(fā)光底物35%。
[0009] 優(yōu)選地，所述試劑盒由下述體積分數組成：磁分離試劑4.76 %，試劑心7.14 %，試 劑R27.14 %，標準品4.76 %，質控品1.59 %，校準品3.17 %，清洗濃縮液23.82 %，稀釋液 15.87%，發(fā)光底物 31.75%。
[0010] 優(yōu)選地，所述試劑盒由下述體積分數組成：磁分離試劑6%，試劑燦％，試劑R28%， 標準品6%，質控品3%，校準品2%，清洗濃縮液30%，稀釋液10%，發(fā)光底物27%。
[0011] 所述試劑盒中各組分按照如下制備方法制得：
[0012] 第一步:磁分離試劑的制備過程
[0013] -、磁珠緩沖液配制操作規(guī)程：
[0014] (1)稱取Tris 4.58g和NaC16.81g于 1L容器中，稱取0.96g Tween-20于20ml容器中 加適量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
[0015] (2)用移液器將Proclin-300量取0.2ml于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入 上述1L容器中；然后在1L容器中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；
[0016] (3)調節(jié)PH計測量其PH值；用4M HC1或4M NaOH調PH，測量其PH在7.95 -8.05之間 即符合要求；
[0017] ⑷稱取BSA V(牛血清白蛋白（第五組分））3g倒入上述1L容器中；
[0018] (5)最后定容至1000ml，測PH值，范圍在7.95 -8.05之間即符合要求，用0.2um濾器 過濾即得;過濾完后貼好標簽于2-8°C冷庫貯存；
[0019] 二、磁分離試劑的配制：
[0020] (1)將l.Omg DSS(辛二酸二琥珀酰亞胺）溶于50ul DMS0中，即濃度為20mg/mL;取 2mgTG抗體溶于PH 9.5的0.1mol/L PB緩沖液中至總體積為lml;
[0021 ] (2)計算DSS的投入量，按照以下公式計算：（抗體質量/16000) X 10 X 368/CDSS)，其 中CDSS指代DSS的物質的量濃度mol/L;
[0022] (3)用移液槍吸取相應體積的DSS加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min;
[0023] (4)將步驟3抗體溶液加入到Centricon-10濃縮管中，然后放入到sigma2-16k高速 冷凍離心機中在3000g的離心力下濃縮約30min至體積為0.5ml;
[0024] (5)取0.5ml磁珠，所述的磁珠直徑在0.9-1.5μηι之間，加入5ml反應杯中，放入專用 試管架，經磁鐵吸附2分鐘后吸取上清；
[0025] (6)每次加入1.5ml PH9.50.1mol/L PB，混勻30秒，上架，去上清，重復操作3次;將 步驟4獲得的抗體溶液加入到磁珠中，混勻后室溫反應4小時，保持混勻狀態(tài)；
[0026] (7)加入0.3ml lmol/L的Tris溶液37°C15分鐘，其中Tris的加樣量為lmg抗體加 0.15mlTris；
[0027] (8)每次加入1.5ml PH 7.20.lmol/L PB清洗已經標記的磁珠，混勻30秒，上架，去 上清，重復操作3次；
[0028] (9)用100ml磁珠保存液將磁珠轉入125ml玻璃瓶，即為0.05%的TG磁分離試劑；
[0029] (10)將步驟9獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1:1的比例混勻，即得本發(fā)明試 劑盒中磁分離試劑。
[0030] 第二步:試劑Ri的制備過程
[0031] 一、試劑R!稀釋液配制操作規(guī)程：
[0032] (1)取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl2 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCh 0.05g 于燒瓶中；然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；
[0033] (2)用4M HC1 或4M NaOH調PH，測量使PH在7.35-7.45范圍內；
[0034] (3)稱取BSA V 3g倒入上述燒瓶中；
[0035] (4)最后定容至1000ml，測PH值，范圍在7.35-7.45之間即符合要求，用0.2um濾器 過濾;過濾完后，貼好標簽于2-8°C冷庫貯存；
[0036] 二、試劑R1的配制(堿性磷酸酶(ALP)與TG單克隆抗體的偶聯）
[0037] (1)取lOmgALP加入5ml生理鹽水中，加入到Centricon-ΙΟ濃縮管中，3000rpm離心 大約20分鐘，濃縮至1毫升。
[0038] (2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaI〇4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
[0039] (3)將上述溶液裝入透析袋中，用ImM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜。
[0040] (4)加2(^10.21^!19.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化41^的?!1升高到9.0~9.5，然后 立即加入2.5mg IgG抗體，在lml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。
[0041 ] (5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4°C2小時。
[0042] (6)將上述液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4PBS透析，4°C過夜。
[0043] (7)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C 1小時。
[0044] (8)3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于 少量 0.15MPH7.4 的 PBS 中。
[0045] (9)將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析約5個小時，去除 銨離子后，l〇〇〇〇rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，加入體積1/100的1M Mgcl2溶液4°C保存。收集到的堿性磷酸酶(ALP)與TG單克