一種快速檢測(cè)單增李斯特菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體采用Fe304/RU(bqy)32+納米微球集成免疫磁珠捕獲技術(shù)和免疫層析快速檢測(cè)單增李斯特菌。
技術(shù)背景
[0002]單核細(xì)胞增生李斯特氏菌簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，是一種人畜共患的食源性致病菌。該菌在自然界中分布廣泛，并且在4°C冰箱保存的食物中仍能生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品中威脅人類健康的主要病原菌之一。單增李斯特菌極易污染肉、蛋、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等食品，引起食物中毒和李斯特菌病的發(fā)生。李斯特菌病具有妊娠期感染多、胎兒嚴(yán)重并發(fā)癥多、免疫受損人群易發(fā)、腦膜腦炎幾率高、死亡率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類身體健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。因此，建立有效的預(yù)警機(jī)制，做到早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早處理，對(duì)保障食品安全和預(yù)防李斯特菌病爆發(fā)具有重大意義。
[0003]目前檢測(cè)單增李斯特菌的金標(biāo)準(zhǔn)是傳統(tǒng)分離鑒定法，該方法需經(jīng)過預(yù)增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生理生化鑒定及血清型鑒定等步驟，整個(gè)過程繁瑣耗時(shí)(3-7天)；PCR方法、電化學(xué)方法以及生物傳感器法對(duì)單增李斯特菌檢測(cè)靈敏度高，然而它們需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間、昂貴的儀器以及專業(yè)的技術(shù)人員。因此，建立快速、簡(jiǎn)單、靈敏的檢測(cè)方法對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)具有重要意義。
[0004]膠體金免疫層析試紙條以其操作簡(jiǎn)單、快速(10-15min)、準(zhǔn)確等特點(diǎn)成為基層篩選的重要工具，然而由于膠體金的光學(xué)信號(hào)有限，膠體金免疫層析試紙條的靈敏度不高，對(duì)單增李斯特菌的檢測(cè)限通常不高于105CFU/mL，這個(gè)缺陷限制了其在食品和農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用。因此，提高試紙條的靈敏度將為單增李斯特菌的檢測(cè)提供簡(jiǎn)單、高效的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供一種快速、靈敏、簡(jiǎn)便的單增李斯特菌定性、定量檢測(cè)技術(shù)。
[0006]本發(fā)明具體方案如下:
[0007]—種快速檢測(cè)單增李斯特菌的方法，包括以下步驟:
[0008]I)納米微球的制備:
[0009]a.添加0.4-0.8mmolFeCl3.6H2O和0.2-1.6mmol FeCl2.4Η20到10mL的去離子水中，向溶液中通入氮?dú)獠⒓訜岬?0-120°C，然后將3-7mL 25%的NH3.H2O添加到混合液中，反應(yīng)2h ；用永磁鐵從反應(yīng)溶液中分離出黑色的固體物質(zhì)用高純水清洗3?5次，得Fe3O4納米粒子；
[0010]b.取12mg Fe3O4納米粒子用1-1OmL去離子水和20mL乙醇的混合液重懸，先在緩慢攪拌的條件下加入0.3-0.9mL的NH4OH溶液，再將10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室溫下反應(yīng)12h，在Fe3O4納米粒子表面形成一層二氧化硅，用去離子水溶液清洗幾次，在乙醇溶液中復(fù)溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4納米粒子；
[0011 ] c.把10_300uL的正娃酸乙酯，20mL無水乙醇，1-1OmL去離子水和ImL 0.5_3mg/L的啡啰啉聯(lián)釕(Ru (bqy )32+)混合，將混合溶液加入0.5mL 二氧化硅包覆的Fe3O4納米粒子，最后加入600-900yL的NH40H，劇烈攪拌3h，得到Fe304/Ru(bqy)32+納米微球，用去離子水清洗備用；
[0012]d.將ImL的巰丙基三甲氧基硅烷添加到1mL的乙醇溶液中，用該混合物復(fù)溶Fe3O4/Ru(bqy)32+納米微球，在常溫下300rpm攪拌12h后，再80°C 300rpm攪拌Ih，離心得到娃燒化的 Fe304/Ru(bqy)32+納米微球；
[0013]e.將硅烷化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球添加到包含0.06g NaHCO3，0.08g十二烷基苯磺酸鈉，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g過硫酸鉀溶液的50mL的水溶液，水浴70°C，200r/min下攪拌，反應(yīng)5h后得羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球；
[0014]2)取0.5_2mg羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球加入ImL偶聯(lián)緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至5-10，加入0.05-0.18mg 1_(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化羧基，及100-600yg抗單增李斯特菌單抗，在溫度37°C時(shí)，放在10_15rpm的旋轉(zhuǎn)儀上偶聯(lián)60-120min，磁分離3-5min，棄上清；用清洗緩沖液沖洗3-5遍之后，取ImL封閉劑與納米微球混合封閉0.5_lh，得到 Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-單抗;
[0015]所述偶聯(lián)緩沖液配制方法如下:將3mL 19.07g/mL的硼砂與7mL 12.37g/mL的硼酸混合后，稀釋10倍體積；
[0016]所述清洗緩沖液配制方法如下:稱取0.43g 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的無菌蒸餾水中，調(diào)pH為5.5-6.0；
[0017]所述封閉劑配制方法如下:取10mg牛血清白蛋白(BSA)加入ImL磷酸鹽(PBS)緩沖液配成封閉劑；
[0018]3)培養(yǎng)單增李斯特菌，將菌液調(diào)整濃度為106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL，各取ImL備用；取待測(cè)樣品溶液lmL、各濃度菌液lmL，分別與100-150yg Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-單抗，于溫度37°C，旋轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)速10-15rpm混合孵育30-60min，孵育后磁分離3_5min后，棄上清，用PBS緩沖液清洗后，復(fù)溶于PBS中得Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-單抗-菌；
[0019]4)免疫層析試紙條的制備:將樣本墊用pH 8.5 0.IM Tris-HCl緩沖液(I %BSA，0.5 %TWeen-20)浸泡處理，置于60°C鼓風(fēng)干燥箱，2h后取出備用;將單增李斯特菌兔多抗和驢抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，濃度均為l-2mg/mL，噴量均為0.75uL/cm，37°C真空干燥過夜取出置于干燥缸中備用;將過濾墊、樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4mm寬的試紙條，裝卡;將制備好的試紙條裝入鋁箔袋中，加干燥劑密封，置于干燥缸中保存?zhèn)溆茫?br>[0020]5)試紙條對(duì)樣品的檢測(cè):將收集到的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-單抗-菌稀釋到50-150yg/mL，取10yL滴加到試紙條加樣孔中，10-15min后，用熒光讀取儀記錄T線、C線熒光強(qiáng)度和T/C的值；
[0021]6)定性分析:用肉眼觀察結(jié)果進(jìn)行定性分析，T線顯色則說明樣品中有單增李斯特菌，T線不顯色則說明樣品中沒有單增李斯特菌或是含有單增李斯特菌的量低于13CFU/mL；
[0022]7)定量分析:使用熒光讀取儀測(cè)量T線、C線的熒光強(qiáng)度，以及T/C值，以不同菌的濃度為橫坐標(biāo)，T/C值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定普通樣品中的單增李斯特菌數(shù)量。
[0023]所述步驟1)?6304/1?11(^95032+納米微球粒徑為80-21011111;
[0024]步驟3)所述免疫層析試紙條是在粘性底板上依次粘貼濾紙、樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙組成。使用單增李斯特菌Fe304/RU(bqy)32+納米微球免疫層析試紙條，同時(shí)使用熒光讀取儀定量檢測(cè)的方法，其特征在于:配制已知系列濃度的單增李斯特菌溶液，用熒光讀取儀測(cè)出其對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，根據(jù)這一系列數(shù)值與對(duì)應(yīng)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將檢測(cè)樣品的試紙條放入熒光讀取儀中，根據(jù)熒光讀取儀輸出的數(shù)值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線圖即可得出樣本中單增李斯特菌的含量。
[0025]本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn):
[0026]I)本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短(10-15min)等優(yōu)點(diǎn)，適于進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；
[0027]2)本發(fā)明技術(shù)方案檢測(cè)穩(wěn)定性好，檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)限能達(dá)到103CFU/mL。采用的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球，不僅具有磁性納米粒子的超順磁性能，對(duì)樣品進(jìn)行濃縮富集，而且具有Ru(bqy)32+納米微球強(qiáng)的光學(xué)信號(hào)、Ru(bqy)32+納米微球表面高效偶聯(lián)抗體的性能，從而提高了試紙條的檢測(cè)靈敏度。
[0028]3)本發(fā)明無需將單增李斯特菌從免疫磁珠上洗脫下來的步驟，提高了捕獲效率；免去了將免疫標(biāo)記物噴在結(jié)合墊上的步驟，免疫學(xué)反應(yīng)更加均一，定量檢測(cè)時(shí)變異系數(shù)小；減少了工作量和雜菌污染概率。
[0029]4)能同時(shí)對(duì)目標(biāo)物單增李斯特菌進(jìn)行定性及定量檢測(cè)。
[°03°] 5)本發(fā)明的標(biāo)記物為羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球，該標(biāo)記物主要通過化學(xué)偶聯(lián)的方式標(biāo)記抗體，相比傳統(tǒng)膠體金(物理吸附作用)，能夠捕獲更多抗體，從而提高檢測(cè)靈敏度，另外，該標(biāo)記物羧基修飾的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)能提高材料的穩(wěn)定性，提高保存期為I年，傳統(tǒng)膠體金保存期為6個(gè)月。
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