31 ] 6)本發(fā)明的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球由于核內(nèi)Fe3(k納米粒子的作用，能更好的防止殼內(nèi)熒光染料Ru (bqy) 32+的泄漏，從而提高熒光強(qiáng)度。
【附圖說明】
[0032]圖1本發(fā)明Fe304/Ru(bqy)32+納米微球免疫層析試紙條對(duì)單增李斯特菌的檢測(cè)
【具體實(shí)施方式】
[0033]本發(fā)明技術(shù)方案制備的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球與單增李斯特菌單抗偶聯(lián)，制備免疫Fe304/Ru(bqy)32+納米微球，并應(yīng)用于免疫層析試紙條對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)。該試紙條基于雙抗夾心的模式，在硝酸纖維膜上分別噴涂單增李斯特菌兔多抗和驢抗鼠二抗作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，如果樣品中含有一定濃度的單增李斯特菌時(shí)，單增李斯特菌就會(huì)首先與免疫Fe304/Ru(bqy)32+納米微球結(jié)合形成Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-抗體-抗原復(fù)合物，該復(fù)合物流經(jīng)檢測(cè)線被單增李斯特菌兔多抗捕獲在檢測(cè)線區(qū)域聚集，聚集到一定濃度形成肉眼可見的條帶或者試紙條讀取儀可以檢測(cè)的信號(hào)，多余的免疫Fe304/RU(bqy )32+納米微球移動(dòng)到質(zhì)控線被驢抗鼠二抗捕獲聚集形成肉眼可見的條帶，判斷其為陽性，如果樣品中不含待檢物，免疫Fe304/Ru(bqy)32+納米微球只與控制線上的驢抗鼠二抗反應(yīng)形成肉眼可見的條帶，檢測(cè)線不顯色，判斷其為陰性。如果質(zhì)控線處沒有顏色或者沒有明顯信號(hào)，說明試紙條有質(zhì)量問題，測(cè)試無效。
[0034]以下結(jié)合本發(fā)明的技術(shù)方案提供實(shí)施例。以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案以具體實(shí)驗(yàn)操作的形式示例，其中的實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)定參數(shù)不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明基本技術(shù)方案的局限。并且本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0035]熒光讀取儀購于上海互幗科技儀器有限公司。
[0036]偶聯(lián)緩沖液配制方法如下:將3mL濃度為19.07g/mL的硼砂與7mL濃度為12.37g/mL的硼酸混合后，稀釋10倍體積；
[0037]清洗緩沖液配制方法如下:稱取0.43g 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的無菌蒸饋水中，調(diào)pH為5.5-6.0 ；
[0038]封閉劑配制方法如下:取10mg牛血清白蛋白(BSA)加入ImL磷酸鹽(PBS)緩沖液配成封閉劑；
[0039]實(shí)施例一:使用Fe304/Ru(bqy)32+納米微球免疫層析試紙條對(duì)牛奶中單增李斯特菌的檢測(cè)
[°04°] I.制備偶聯(lián)單抗的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球
[0041 ] I.lFe304/Ru(bqy )32 +納米微球的制備:添加0.6mmolFeCl3.6H2O和0.3mmoIFeCl2.4H20到10mL的去離子水中，向溶液中通入氮?dú)獠⒓訜岬?0°C，然后將4.7mL 25%的NH3.H2O添加到混合液中，反應(yīng)2h。用永磁鐵從反應(yīng)溶液中分離出黑色的固體物質(zhì)用高純水清洗3?5次，得Fe304納米粒子;取12mg Fe3(k納米粒子用3mL去離子水和20mL乙醇的混合液重懸，先在緩慢攪拌的條件下加入0.5mL的NH4OH溶液，再將50uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室溫下反應(yīng)12h，在Fe3O4納米粒子表面形成一層二氧化硅，用去離子水溶液清洗幾次，在乙醇溶液中復(fù)溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4納米粒子;把10uL的正硅酸乙酯，20mL無水乙醇，3mL去離子水和ImL 0.5_3mg/L的啡B羅啉聯(lián)^!了 (Ru (bqy) 32+)混合，將混合溶液加入0.5mL 二氧化硅包覆的Fe3O4納米粒子，最后加入750yL的NH4OH，劇烈攪拌3h，得到Fe304/Ru(bqy)32+納米微球，用去離子水清洗備用;將ImL的巰丙基三甲氧基硅烷添加到1mL的乙醇溶液中，用該混合物復(fù)溶Fe304/Ru(bqy)32+納米微球，在常溫下300rpm攪拌12h后，再80°C 300rpm攪拌lh，離心得到硅烷化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球；將硅烷化的Fe304/Ru(bqy )32+納米微球添加到包含0.06g NaHCO3，0.08g十二烷基苯磺酸鈉，0.05mL苯乙烯，
0.15mL丙烯酸和0.5g過硫酸鉀溶液的50mL的水溶液，水浴70°C，200r/min下攪拌，反應(yīng)5h后得羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球；
[0042]1.2.偶聯(lián)反應(yīng):取1.0mg羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球加入ImL偶聯(lián)緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至8，加入0.05-0.18mg 1_(3_二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化羧基，及220yg抗單增李斯特菌單抗，在溫度37°C時(shí)，放在10_15rpm的旋轉(zhuǎn)儀上偶聯(lián)60-120min，磁分離3-5min，棄上清；用清洗緩沖液沖洗3-5遍之后，取ImL封閉劑與磁珠混合封閉0.5_lh，得到Fe304/Ru (bqy) 32+納米微球-單抗。
[0043]2.使用免疫Fe304/Ru(bqy )32+納米微球捕獲牛奶中的單增李斯特菌
[0044]取25mL的滅菌后牛奶加入到225mL培養(yǎng)基中，接種一定濃度的單增李斯特菌，在36°(3的條件下，震蕩培養(yǎng)8-18h。將菌液濃度調(diào)整為106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、13CFU/mLo
[0045]取ImL各濃度菌液、ImL待測(cè)樣品溶液，分別加入120yg Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-單抗，溫度37°C，轉(zhuǎn)速10-15rpm混合孵育30-60min;孵育后磁分離3_5min后，棄上清，用PBS緩沖液清洗后，復(fù)溶于PBS中得Fe304/Ru( bqy )32+納米微球-單抗-菌。
[0046]3.制作單增李斯特菌免疫層析試紙條
[0047]將樣本墊用PH8.5 0.1M Tris-HCl緩沖液(l%BSA，0.5%Tween_20)處理，置于60°C鼓風(fēng)干燥箱，2h后取出置于干燥缸中備用;將單增李斯特菌兔多抗和驢抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，濃度均為1.0mg/mL，噴量均為0.75uL/cm，37°C真空干燥過夜取出置于干燥缸中備用;將過濾墊、樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4_寬的試紙條，裝卡。將制備好的試紙條裝入鋁箔袋中，加干燥劑密封，置于干燥缸中保存?zhèn)溆谩?br>[0048]4.利用雙抗夾心法對(duì)樣品進(jìn)行目測(cè)和使用儀器測(cè)定結(jié)果
[0049]將捕獲收集到的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球-單抗-菌稀釋到100yg/mL，取10yL滴加到試紙條加樣孔中，10-15min后，用熒光讀取儀記錄T線、C線熒光強(qiáng)度和T/C的值;用肉眼觀察結(jié)果進(jìn)行定性分析，T線顯色則說明樣品中有單增李斯特菌，T線不顯色則說明樣品中沒有單增李斯特菌或是含有單增李斯特菌的量低于103CFU/mL。
[0050]參考所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，確定樣品中單增李斯特菌的數(shù)量。定量檢驗(yàn)菌濃度的范圍在13-106CFUAiL。本發(fā)明方法檢測(cè)穩(wěn)定，檢測(cè)線可以低至13CFlVmL，速度快，效果好。[0051 ]實(shí)施例二:使用Fe304/Ru(bqy)32+納米微球免疫層析試紙條對(duì)牛肉中單增李斯特菌的檢測(cè)
[0052]1.制備偶聯(lián)單抗的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球
[0053]I.lFe3 04/Ru(bqy )32 +納米微球的制備:添加0.6mmol FeC13.6H2O和0.3mmolFeCl2.4H20到10mL的去離子水中，向溶液中通入氮?dú)獠⒓訜岬?0°C，然后將4.7mL 25%的NH3.H2O添加到混合液中，反應(yīng)2h。用永磁鐵從反應(yīng)溶液中分離出黑色的固體物質(zhì)用高純水清洗3?5次，得Fe304納米粒子;取12mg Fe3(k納米粒子用3mL去離子水和20mL乙醇的混合液重懸，先在緩慢攪拌的條件下加入0.5mL的NH4OH溶液，再將50uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室溫下反應(yīng)12h，在Fe3O4納米粒子表面形成一層二氧化硅，用去離子水溶液清洗幾次，在乙醇溶液中復(fù)溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4納米粒子;把10uL的正硅酸乙酯，20mL無水乙醇，3mL去離子水和ImL 0.5_3mg/L的啡B羅啉聯(lián)^!了 (Ru (bqy) 32+)混合，將混合溶液加入0.5mL 二氧化硅包覆的Fe3O4納米粒子，最后加入750yL的NH4OH，劇烈攪拌3h，得到Fe304/Ru(bqy)32+納米微球，用去離子水清洗備用;將ImL的巰丙基三甲氧基硅烷添加到1mL的乙醇溶液中，用該混合物復(fù)溶Fe304/Ru(bqy)32+納米微球，在常溫下300rpm攪拌12h后，再80°C 300rpm攪拌lh，離心得到硅烷化的Fe304/Ru(bqy)32+納米微球；將硅烷化的Fe304/Ru(bqy )32+納米微球添加到包含0.06g NaHCO3，0.08g十二烷基