一種聚乙二醇含量的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物制劑的含量測(cè)定方法領(lǐng)域，涉及一種載藥醫(yī)療器械藥物涂層的分 析方法，具體涉及一種聚乙二醇含量的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚乙二醇（簡稱:PEG)由環(huán)氧乙烷與水縮聚而成，分子式為H0(CH2CH 20)nH，n代表氧 乙烯基的平均數(shù)，其CAS登記號(hào)為25322-68-3，為白色蠟狀固體薄片或顆粒狀粉末，略有特 臭。聚乙二醇溶于水、乙醇及許多有機(jī)溶劑，在乙醚中不溶，對(duì)熱、酸、堿穩(wěn)定，與許多化學(xué)品 不起作用。
[0003] 聚乙二醇具有無毒、無刺激、免疫原性低等特點(diǎn)，其生物相容性好、可通過腎排出 體外，在體內(nèi)不會(huì)有積累。此外，聚乙二醇具有一定的化學(xué)惰性，與其他藥物和載體的配伍 性好?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，聚乙二醇被中國、美國、英國等許多國家藥典收載作為藥用輔料，被廣 泛應(yīng)用于各種藥物制劑中。
[0004] 聚乙二醇在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用主要在以下幾個(gè)方面：（一）作為藥用輔料：聚乙 二醇可用作注射用的復(fù)合溶劑，作為難溶于水藥物的溶媒，也可作為栓劑基質(zhì)、軟膏基質(zhì)、 助懸劑、增粘劑和增塑劑等，還可用作固體分散體的載體，制備一些難溶性藥物的低共熔物 以加速藥物的溶解和吸收，在注射劑、眼用制劑、口服和直腸用制劑等劑型中應(yīng)用廣泛； (二)對(duì)多肽和蛋白類藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，可改善藥物的以下性質(zhì)同時(shí)最大限度地保留其生 物活性:增加穩(wěn)定性，降低酶降解作用;改善藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，如延長血漿半衰期、降低最大 血藥濃度、血藥濃度波動(dòng)減小等;降低免疫原性、抗原性和毒副作用;改善體內(nèi)藥物分布，增 強(qiáng)靶向性；（三)作為生物醫(yī)用材料的表面改性材料:通過化學(xué)接枝或本體共聚等方法，將聚 乙二醇接枝或富集到材料表面，能防止與血液接觸時(shí)，血液中的血小板在材料表面沉積，改 善與血液接觸的醫(yī)用高分子材料的生物相容性。
[0005] 藥物與器械組合治療系統(tǒng)是指含有藥物和器械的二個(gè)元件通過某種方式組合為 單一的產(chǎn)品，其目的在于補(bǔ)充現(xiàn)有的給藥系統(tǒng)的不足，或補(bǔ)充現(xiàn)有的醫(yī)療器械的不足，或增 加新的醫(yī)療用途等。藥物洗脫球囊和藥物洗脫支架均屬于藥物與器械組合治療系統(tǒng)，其中 的藥物洗脫球囊(簡稱:DEB)是在球囊擴(kuò)張術(shù)或球囊成形術(shù)等介入技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的 新型治療性球囊藥物釋放技術(shù)，其原理在于將抗增生性的藥物如紫杉醇，通過某些特殊的 工藝涂覆于球囊表面，通過介入手術(shù)將球囊輸送到病變血管部位，隨后球囊被充壓撐開，在 與血管壁內(nèi)膜接觸時(shí)，球囊表面的藥物被快速釋放、轉(zhuǎn)移至局部血管壁上，繼而發(fā)揮藥效， 起到抗血管內(nèi)膜增生的作用，從而預(yù)防血管介入術(shù)后的血管再狹窄。
[0006] 將紫杉醇藥物直接涂覆在球囊表面，并不能達(dá)到理想的治療效果。存在的問題主 要表現(xiàn)在:涂覆后藥物涂層外觀不均勻，藥物涂層與球囊的結(jié)合力太弱，涂層過于松散，在 施行介入手術(shù)過程中，藥物受到血流的快速?zèng)_刷，極易發(fā)生脫落。這種輸送過程中的損失會(huì) 導(dǎo)致在到達(dá)靶病變血管及球囊擴(kuò)張前，可供釋放轉(zhuǎn)移的藥物總量過少，藥物轉(zhuǎn)載率過低，不 能獲得理想的療效。因此，必須通過采用合適的賦形劑品種及組合，才能獲得較好的治療效 果，而原料藥與輔料的搭配比例，也是影響藥物洗脫球囊療效的重要因素。
[0007] 聚乙二醇是最常用的水溶性藥物載體之一。但是其分子量的大小及用量會(huì)顯著影 響藥物涂層的有效性和安全性。因此，準(zhǔn)確監(jiān)控藥物涂層中聚乙二醇的含量，對(duì)生產(chǎn)工藝和 產(chǎn)品的質(zhì)量控制有著重要的意義。
[0008] 由于聚乙二醇是由環(huán)氧乙烷和水縮聚而成的混合物，因此不易準(zhǔn)確測(cè)定其含量。 在中國藥典2015年版二部聚乙二醇系列品種項(xiàng)下，未制訂其含量測(cè)定項(xiàng)目。美國藥典34版 (簡稱:USP34)、英國藥典2011年版(簡稱:BP2011)和中國藥典2015年版(簡稱:ChP2015)均 采用毛細(xì)管黏度計(jì)測(cè)定其運(yùn)動(dòng)黏度，計(jì)算樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。
[0009] 目前通用的國際標(biāo)準(zhǔn)方法是采用二相萃取的Weibull法，其原理是非離子加成物 和聚乙二醇都溶于乙酸乙酯，但聚乙二醇還可以溶于氯化鈉溶液，非離子加成物則不溶。該 方法的缺點(diǎn)是操作繁瑣，溫度控制要求嚴(yán)格，測(cè)定周期長(大約需8~10h)，并且靈敏度不 尚。
[0010]國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17830-1999《聚乙氧基化非離子表面活性劑中聚乙二醇含量的測(cè) 定高效液相色譜法》以C18硅膠鍵合相色譜柱，純甲醇或甲醇/水混合溶劑做流動(dòng)相，對(duì)聚醚 型非離子表面活性劑進(jìn)行反相高效液相色譜法分離，用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)流出物，記錄 被分離組分的保留時(shí)間及其峰面積，并通過計(jì)算儀器的響應(yīng)因子來求得分析樣品中聚乙二 醇的百分含量。該方法的局限性在于，只適用于測(cè)定聚乙氧基化脂肪醇和聚乙氧基化烷基 酚中聚乙二醇的含量，不能將該方法推廣到其他情形下聚乙二醇的含量測(cè)定，同時(shí)該方法 需要計(jì)算儀器的響應(yīng)因子，試驗(yàn)結(jié)果以百分含量計(jì)算，進(jìn)一步限制了該方法的使用范圍。 [0011]歐盟標(biāo)準(zhǔn)EN 12582-1999《表面活性劑用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定乙 氧基非離子型表面活性劑中以摩爾質(zhì)量表示的聚乙二醇含量》以C18硅膠鍵合相色譜柱，采 用線性梯度洗脫，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，并通過配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液制作出校準(zhǔn)曲 線，根據(jù)聚乙二醇峰面積確定樣品中聚乙二醇的百分含量。
[0012] 上述采用高效液相色譜（簡稱:HPLC)測(cè)定聚乙二醇含量的方法，均使用十八烷基 硅烷鍵合硅膠填料的色譜柱進(jìn)行反相洗脫，洗脫的流動(dòng)相常使用甲醇、乙腈、水等。其原理 是待分析物質(zhì)按疏水性大小進(jìn)行分離，極性越大、疏水性越小的物質(zhì)，越不易與非極性的固 定相結(jié)合，所以先被洗脫下來。聚乙二醇由于含有較多的羥基及氧孤對(duì)電子，使其具有較大 的極性、較強(qiáng)的親水性，易形成氫鍵，其與色譜柱填料的親和力很弱，最先被洗脫出來，而且 樣品中的水分和其他溶劑，以及洗脫用溶劑也會(huì)干擾聚乙二醇的出峰，分離度欠佳，影響定 量結(jié)果。
[0013] 另外，上述測(cè)定方法的結(jié)果表達(dá)均為樣品中所含有的聚乙二醇百分含量，無法直 觀地得到樣品中的聚乙二醇的絕對(duì)含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種聚乙二醇含量的檢測(cè)方 法。本發(fā)明的檢測(cè)方法利用樣品中各組分流體力學(xué)體積大小的不同，通過優(yōu)化色譜條件，使 用體積排阻色譜柱，通過選擇合適的色譜柱填料凝膠的粒徑和孔徑大小實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的分離， 再通過實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的通用檢測(cè)器，如示差折光檢測(cè)器鑒別聚乙二醇的色譜峰，并通過外標(biāo) 法回歸，進(jìn)而定量樣品中聚乙二醇的絕對(duì)含量。本發(fā)明的檢測(cè)方法解決了常規(guī)方法中分離 度不佳，微量含量測(cè)試準(zhǔn)確度不高，測(cè)試結(jié)果只能以百分含量表達(dá)等的限制。
[0015] 本發(fā)明提供一種聚乙二醇含量的檢測(cè)方法，主要包括以下步驟：
[0016] 采用反相鍵合體積排阻色譜柱，將與樣品中的待測(cè)聚乙二醇分子量相等、分散度 相同或相似的聚乙二醇標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相溶解并稀釋，配制成一定濃度梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)液；
[0017] 將所述系列標(biāo)準(zhǔn)液過濾后分別進(jìn)樣，記錄檢測(cè)器的峰信號(hào)，按外標(biāo)法，以不同濃度 的聚乙二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度做線性回歸，得出校準(zhǔn)曲線，聚乙 二醇的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程為：
[0018] Y = aX+b，
[0019] 其中，a為標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線的斜率，b為標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線的截距，Y為聚乙二醇在檢測(cè)器 輸出的信號(hào)峰面積，X為聚乙二醇濃度，單位為yg/mL;
[0020] 將待測(cè)樣品用定量的流動(dòng)相溶解，過濾后進(jìn)樣，利用所述標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程以及 樣品中聚乙二醇的信號(hào)峰面積，計(jì)算樣品中聚乙二醇的含量。
[0021 ]所述反相鍵合體積排阻色譜柱的載體為硅膠基質(zhì)，固定相為硅膠填料。
[0022]所述外標(biāo)法的外標(biāo)物為聚乙二醇。所述用于外標(biāo)法的外標(biāo)物聚乙二醇的分子量及 分散度與樣品中待檢測(cè)的聚乙二醇相同或相似。
[0023 ] 所述硅膠填料的粒徑范圍為1~2 0 μπι，優(yōu)選3 μπι或5 μπι。所述硅膠填料的孔徑為 8〇Α、100Α、丨50人、300Α 或 500Α,
[0024] 所述硅膠填料的粒徑范圍優(yōu)選3μηι或5μηι。
[0025]所述流動(dòng)相為含離子對(duì)溶劑的乙腈水溶液。所述離子對(duì)溶劑為磷酸、三氟乙酸、甲 酸、乙酸、高氯酸或甲基磺酸，優(yōu)選磷酸或三氟乙酸。所述離子對(duì)溶劑用于調(diào)節(jié)流動(dòng)相的ΡΗ 值，使樣品的疏水性增加，延長洗脫時(shí)間，提高分辨率和分離效果。
[0026]所述乙腈水溶液中乙腈的體積分?jǐn)?shù)范圍為5~95%，所述離子對(duì)溶劑在流動(dòng)相中 的體積分?jǐn)?shù)范圍為0.02~1%;所述乙腈和離子對(duì)溶劑均為色譜級(jí)溶劑，所述水為超純水。 [0027]所述反相鍵合體積排阻色譜柱的色譜條件為:流動(dòng)相流速范圍為0.1~2mL/min， 優(yōu)選為0.5~