B-C18(3.5ym，150X4.6mm i.d.)柱。用由ρΗ4·65的0.1M乙酸鈉組成的流動相以 0.5ml/分鐘的流速等度洗脫3HK。流動相為新鮮制備，并且在使用前過濾。使用多波長UV檢 測器在365nm處檢測3HK〇
[0103] 使用HPLC在10nM或更大檢測界限內(nèi)的3HK的測定內(nèi)變異系數(shù)和測定間變異系數(shù)為 5% 至 7%〇
[0104] 免疫組織化學
[0105] 腦切片制備
[0106] 使用下述抗體:HLA-DR mAb(l:100稀釋度，DAK0)、QUIN mAb(IgGl，l:100稀釋度， Chemicon Millipore)。獲得厚度為5μηι的石錯切片，并使其從38°C水浴(HD Scientific)漂 浮到Superfrost Ultra Plus(Thermo Scientific)載玻片上。將切片在組織干燥箱 (Medi te)中于45°C干燥過夜。然后，經(jīng)如下轉(zhuǎn)移使切片水合:兩次更換二甲苯然后兩次更換 無水醇，梯度醇濃度(分別為90 %和70 % )，然后更換為水。通過在室溫下將切片置于3 %過 氧化氫(H2〇2)/甲醇溶液中20分鐘封閉內(nèi)源性過氧化物酶。
[0107] HLA-DR 染色
[0108]將用于HLA-DR抗體染色的切片置于pH 6.0的檸檬酸緩沖液中，并且在高壓釜 (Siltex)中于120°C下誘導抗原性修復20分鐘。然后，在室溫下將切片在終濃度為3%、含有 無菌馬血清（Invitrogen)的pH 7.6的0.1M三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)緩沖鹽水中洗滌5分 鐘。用PAP筆（DAK0 Cytomation，Copenhagen，Denmark)圈出切片。然后，向切片施加抗體并 在室溫下孵育1小時。將抗體洗離切片，然后再在室溫下置于PH6.0的TRIS緩沖液中5分鐘。 然后，向切片施加Envision(DAKO)連接聚合物，并在室溫下孵育30分鐘。如下使過氧化物酶 標記可視化：在室溫下將切片在含0.03 %H2〇2/0.05 % 3，3-二氨基聯(lián)苯胺四氯化物(DAB， Sigma D5637)的0.1M pH 7.6TRIS緩沖液中孵育2分鐘，然后進行水漂洗。最后，將切片在 Harris蘇木精中對比染色2分鐘，然后在1 %酸醇中分化3秒并在Scott上藍溶液中染成藍 色。然后，將切片脫水，在二甲苯中清洗，并且然后封固在Pertex封固介質(zhì)(HD Scientific) 中。
[0109] QUIN染色
[0110] 將用于QUIN抗體染色的切片短暫置于含10%無菌馬血清的0.1M pH 7.5Tris-HCl 緩沖液、0·15MNaCl(TNB)，和0·5%封閉劑（PerkinElmer，Zaventem，Belgium)中。然后，將 切片在0.1M pH 7.5Tris-HCl緩沖液、0.3M Nacl、0.05%Tween-20(TNT)中洗滌3次，每次洗 3分鐘。用PAP筆圈出切片并向每個載玻片添加兩滴抗生物素蛋白溶液，持續(xù)15分鐘，然后在 TNT中洗滌兩次，每次洗3分鐘。向每個切片添加兩滴生物素并孵育15分鐘。將切片在TNT中 洗滌兩次，每次洗3分鐘，然后在pH 6.0檸檬酸緩沖液中于120°C下高壓滅菌20分鐘。繼高壓 滅菌之后，使切片在修復溶液中冷卻，然后在TNT中洗滌3次，每次3分鐘。將切片置于含10% 馬血清的TNB中30分鐘。將QUINN抗體以1:100的稀釋度施加到測試切片，而向同種型對照切 片施加小鼠IgGl(在TNB中以1:15稀釋），其蛋白質(zhì)濃度與所使用的抗體相等。將馬血清(在 TNB中10 % )倒出切片，并向合適的切片施加抗體或小鼠IgGl，保持1小時。然后，將切片在 TNT中洗滌3分鐘，進行3次。然后，在室溫下向所有切片施加（1:200稀釋度)二抗(生物素化 的抗小鼠抗體），保持30。將切片洗滌3次，持續(xù)3分鐘，施加抗生物素蛋白-生物素復合物 (ABC elite，Vector Laboratories)，保持30分鐘，并再次洗滌3分鐘，進行3次。向切片施加 Biotinyl Tramide( 1: 50稀釋度，Invitrogen)，保持10分鐘，然后用TNT洗去3次，進行3分 鐘。然后，將切片在室溫下于SA-HRP( 1:100稀釋度，Invitrogen)中孵育30分鐘，隨后在DBA 中于室溫下顯色3分鐘。將切片在流動的自來水中洗滌20分鐘，然后在Harris蘇木精中對比 染色30秒。將切片在水中洗滌并在酸醇（1 % )中浸漬一次，然后在水中漂洗并染藍(Scott上 藍溶液)持續(xù)1分鐘，在水中洗滌，脫水至二甲苯，然后永久地封固在Fas tmount中。
[0川]H&E染色
[0112] 將切片置于自來水中，并在Harr is蘇木精中染色5分鐘。然后，將切片在水中洗滌， 并在1 %酸醇中分化3秒。將切片在Scott上藍溶液中染藍，在自來水中再次洗滌，在醇中脫 水，在二甲苯中清洗，并用Pertex封固。
[0113] 盧克斯固藍/甲酚紫染色
[0114] 將切片置于水中，然后在95 %醇中漂洗，并在經(jīng)預熱(60°C)的LFB工作溶液中染色 2小時。然后，使切片在室溫下冷卻1小時。然后，將切片置于4°C、pH 10.5的碳酸鋰中并攪拌 10分鐘。在70 %醇中使切片分化75秒。在流動的自來水中洗滌10分鐘。在蒸餾水中漂洗，并 用0.1 %甲酚紫對比染色10分鐘。將切片在自來水中快速洗滌，然后通過3次更換無水醇緩 慢脫水以除去過量的甲酚紫，隨后清洗并封固。
[0115] 統(tǒng)計學分析
[0116] 在本文通篇，所有數(shù)據(jù)均以具有標準差的中值表示。使用參數(shù)單因素方差分析 (AN0VA)，然后通過事后Turkey比較分析對n>15的組之間的差異顯著性進行統(tǒng)計學比較。p 值<0.05被認為具有統(tǒng)計學顯著性。對n<15,使用非參數(shù)Kruskall-Wallis方差和Mann-Whi tney比較分析。由于比較分析，我們使用p值<0.01作為顯著閾值，而使用p值<0.05來 展現(xiàn)趨勢。使用GraphPad Prism 5軟件包示出圖形圖表，而使用SPSS版本17.0進行統(tǒng)計學 分析。
[0117] 結(jié)果
[0118] MS進展中的KP活化
[0119] 已使用三個參數(shù)來評價來自MS患者的血清樣品和CSF樣品兩者中的KP活化，即 TRP、KYN和K/T比。發(fā)明人的數(shù)據(jù)表明，相比較于對照，TRP(即驅(qū)使KP的第一底物)在所有MS 亞型的血清中均顯著降低（圖1)。發(fā)明人在來自血清樣品和CSF樣品的MS亞型內(nèi)未發(fā)現(xiàn)TRP 降解與疾病嚴重程度的相關(guān)性中存在任何差異。然而，統(tǒng)計學分析揭示，相比較于疾病早 期，存在從進展型MS表現(xiàn)出TRP降低的趨勢（圖lA&C-p<0.05)。該結(jié)果在匹配的CSF樣品中 進一步驗證（圖1D中的空心三角形），其顯示TRP濃度降低。此外，圖lC&D(p<0.05)中將SPMS 的活動性形式與其非活動性形式進行比較，我們發(fā)現(xiàn)類似的TRP降低趨勢。
[0120]在MS中TRP的直接代謝物KYN也增加。從HBSFRC獲得的樣品顯示，來自血清樣品的 KYN具有增加趨勢(p<0.05)并且在MS的活動性形式中顯著增加。KYN的這種增加在匹配的 CSF樣品中也是顯著的（p<0.01)。然而，與其匹配的血清樣品相反，我們發(fā)現(xiàn)CSF中來自活 動性SPMS的KYN降低。
[0121] 在ACPMS樣品中，除RRMS(p<0.05，數(shù)據(jù)未示出）之外在MS亞型和對照之間均未觀 察到血清KYN的顯著差異。
[0122] 相較于對照，所得的描述KYN和TRP反比關(guān)系的K/T比在MS中增加。用于評價KP活化 并且指示ID0活性的K/T比表明KP的確在MS中被活化。此外，在匹配的CSF樣品中也觀察到了 顯著高于其對照的相似趨勢。然而，我們的數(shù)據(jù)顯示K/T比的升高與疾病的嚴重程度無顯著 相關(guān)性。
[0123] MS進展中的神經(jīng)保護性KP代謝物
[0124] 下表3和4示出了獲得的血清和CSF的神經(jīng)保護性KP代謝物水平。
[0125] 表3-來自ACPMS之MS患者血清中的色氨酸、犬尿氨酸和K/T比。
[0127] 表4-來自HBSFRC之MS患者的色氨酸、犬尿氨酸和K/T比的血清和匹配的CSF。
[0128]
[0129] KYNA 濃度
[0130] 發(fā)現(xiàn)神經(jīng)保護性KP代謝物KYNA在RRMS患者的血清中升高。然而，隨著疾病的進展， 我們觀察到SPMS和PPMS兩者中的這種神經(jīng)保護性代謝物均降低。此外，在SPMS血清和匹配 的CSF中，相比較于其對應形式，在活動性形式中顯示KYNA減少的趨勢更顯著(p<0.05)。
[0131] PIC 濃度
[0132] 另一種神經(jīng)保護性KP代謝物PIC遵循與KYNA相似的趨勢。發(fā)現(xiàn)PIC在RRMS患者的血 清中增加，但在SPMS患者和PPMS患者中降低。同樣，相比較于其非活動性形式，PIC的降低進 一步延伸至SPMS的活動性形式(p<0.01)。
[0133] MS進展中的神經(jīng)毒性QUIN產(chǎn)生
[0134] 下表5和6及圖2示出了來自具有不同MS嚴重程度的對象的血清和CSF中喹啉酸的 水平。
[0135] 表5-來自ACPMS之MS患者的血清中的神經(jīng)保護性KP代謝物。
[0137] 表6-來自HBSFRC之MS患者中神經(jīng)保護性KP代謝物的血清和匹配的CSF
[0138]
[0139] 相比較于對照，QUIN濃度在所有MS亞型中均升高。血清中QUIN產(chǎn)生的增加也與疾 病嚴重程度相關(guān)(P<〇.0001)。在匹配的CSF樣品中也發(fā)現(xiàn)了 QUIN的這種增加。此外，相比于 較不嚴重的MS形式（即RRMS)，在進展型MS中似乎存在QUIN顯著增加的趨勢。
[0140]當與健康對照進行比較時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)3HK在所有MS亞型的血清中均顯著增加。此 外，相比較于RRMS，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在進展型MS中3HK具有增加趨勢，但未達到統(tǒng)計學上顯著(p =0.045)。有趣的是，在另一組