用于從維生素d結(jié)合蛋白解離維生素d的溶液、相關(guān)的檢測方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測維生素D的技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了氟代烷基表面活性 劑與醇的聯(lián)合用于從維生素D結(jié)合蛋白釋放維生素D和/或其代謝物之一的用途，包含這樣 的聯(lián)合的溶液，使用這樣的聯(lián)合檢測/定量維生素D和/或維生素D的至少一種代謝物的體外 方法，以及用于通過免疫測定使用這樣的聯(lián)合來檢測/定量的試劑盒。
[0002] 維生素D是參與許多人體和動(dòng)物體生物學(xué)過程的重要物質(zhì)。其中，已知生物學(xué)活性 的維生素D尤其調(diào)節(jié)來自腸道的鈣固定，以及骨礦化，并且其影響許多其他代謝途徑，例如 胰島素系統(tǒng)。維生素D的缺乏或過量可產(chǎn)生許多后果。特別是，已知維生素D缺乏導(dǎo)致嚴(yán)重的 疾病，如骨質(zhì)疏松和軟骨病。
[0003] 此外，過量的維生素D(特別是由于過度施用)具有毒性。特別是，高水平的維生素D 可導(dǎo)致由于腸道鈣吸收的增加引起的高鈣血癥。維生素D的其他毒性作用表現(xiàn)為血壓升高， 胃腸問題，如厭食、惡心，通常隨后伴有尿的過度產(chǎn)生、煩渴、疲勞、神經(jīng)緊張、瘙癢或甚至是 腎衰竭。
[0004] 如申請W0 2012/091569中所提到的，近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，維生素D調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)并且 降低炎癥。該申請還表明，維生素D能夠防止結(jié)腸、卵巢和乳房的癌癥。
[0005] 因此，能夠測量或定量維生素D，即確定其濃度，從而揭示任何潛在的缺陷或過量， 這是重要的。
[0006] 維生素D以兩種形式存在于有機(jī)物中，即以下列出的式的維生素D2(鈣化醇）和維 生素D3(膽鈣化醇）（其中維生素D中的位置編號按照留醇命名法）。
[0007] 維生素D2(鈣化醇）：
[0009] 維生素D3(膽鈣化醇）：
[0011] 維生素02是維生素D的外源形式，其來源于食物。維生素D3是維生素D的內(nèi)源形式， 其由生物體在來自陽光的紫外線對皮膚的作用下產(chǎn)生。由皮膚產(chǎn)生的維生素D 3與維生素D 結(jié)合蛋白結(jié)合，該維生素D結(jié)合蛋白將其運(yùn)輸至肝。這兩種形式也可以來源于營養(yǎng)補(bǔ)充劑。 產(chǎn)生了維生素D的多種代謝物。特別是，發(fā)生了兩步代謝，第一步在于產(chǎn)生25-羥基維生素D (D 2或D3)，隨后產(chǎn)生1,25-二羥基維生素D(D2或D3)。
[0012] 測量維生素D自身的量受到的關(guān)注有限，因?yàn)槠錆舛茸鳛樯攀车暮瘮?shù)而劇烈波動(dòng)。 這同樣適用于1，25_二羥基維生素D代謝物，其以相當(dāng)?shù)偷臐舛却嬖诓⑶乙膊▌?dòng)。
[0013] 維生素D的循環(huán)形式主要是25-羥基維生素D型的代謝物。因此，獲得關(guān)于患者的維 生素D的總濃度的信息的優(yōu)選方式是測定25-羥基維生素D。
[0014] 25-羥基維生素D或更概括而言維生素D及其代謝物與維生素D結(jié)合蛋白（DBP)的結(jié) 合使得測定其組分復(fù)雜化。為了獲得充分的測定，有必要通過使DBP與半抗原解離來從DBP 釋放待檢測的半抗原。因此，已經(jīng)提出多種溶液用于在解離DBP之后和檢測之前獲得維生素 D及其代謝物的釋放。
[0015] 已經(jīng)開發(fā)了專利申請W0 2007/039194和專利申請W0 2012/091569中列出的多種 技術(shù)。僅僅將它們中的一些在下文列出。
[0016] 在申請W0 99/67211中具體使用的舊技術(shù)在于制備血漿或血清樣品，以通過乙醇 沉淀測定維生素D。然后，除去沉淀，以回收含有維生素D的可溶代謝物的乙醇上清液。過去 經(jīng)常使用借助于醇或另一有機(jī)溶劑(如乙腈)的沉淀。然而，該技術(shù)不能夠自動(dòng)化，并且需要 許多手工操作（向血清加入溶劑、混合、離心、回收有機(jī)相、在柱上或另外干燥，再懸浮于液 體溶劑），因此由于在操作者之間觀察到的高度變化而使其最近被廢棄。
[0017] 專利申請W0 2007/039194提出使用含有5體積％至30體積％-種或多種兩性試劑 和任選的0.7體積％至8體積％的短鏈醇(&-C3)的溶液，所述一種或多種兩性試劑選自二甲 基亞砜(DMS0)和液體有機(jī)酰胺的。該文件中使用的兩性化合物是毒性的或如果其為DMS0時(shí) 甚至是危險(xiǎn)的物質(zhì)。
[0018] Future Diagnostics的專利申請W0 2011/122948和W0 2012/091569描述了能夠 從維生素D的結(jié)合蛋白釋放維生素D并且使用了氟代烷基表面活性劑的免疫測定和試劑。申 請人已經(jīng)使用了該溶液，但是發(fā)現(xiàn)所獲得的解離仍然是不充分的。
[0019] 本發(fā)明的目標(biāo)是提供了易于實(shí)施并且導(dǎo)致在解離維生素D結(jié)合蛋白（DBP)后維生 素D及其代謝物有效釋放，隨后能夠使它們被充分檢測并定量的更有效的解離技術(shù)。
[0020] 在本發(fā)明的上下文中，目標(biāo)是提供一種從維生素D結(jié)合蛋白（DBP)解離維生素D或 其一種代謝物的新的溶液，其比Future Diagnostics在其專利申請W0 2011/122948和TO 2012/091569中提出的現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)更加有效。此外，本發(fā)明中描述的溶液沒有呈現(xiàn)出尤 其是在專利申請W0 2007/039194所提出的溶液的毒性問題。
[0021] 在本文中，本發(fā)明提供了至少一種氟代烷基表面活性劑(且特別是全氟代烷基表 面活性劑)和至少一種具有1至4個(gè)碳原子的醇用于從維生素D結(jié)合蛋白解離維生素D和/或 維生素D代謝物的用途。與區(qū)別僅在于缺乏醇的類似使用相比，這樣的結(jié)合使用使其能夠顯 著增加維生素D或其一種代謝物從維生素D結(jié)合蛋白解離的速率。在本發(fā)明的用途中，將氟 代烷基表面活性劑(且特別是全氟代烷基表面活性劑)和具有1至4個(gè)碳原子的醇摻入包含 與維生素D結(jié)合蛋白結(jié)合的維生素D和/或維生素D代謝物(稱為分析物或維生素D分析物）的 液體樣品。因此，用于解離的分析物與氟代烷基表面活性劑和醇兩者接觸，它們當(dāng)一起使用 時(shí)能夠比使用相同的氟代烷基表面活性劑本身實(shí)現(xiàn)更大的解離。氟代烷基表面活性劑(且 特別是全氟代烷基表面活性劑)和具有1至4個(gè)碳原子的醇的聯(lián)合使用導(dǎo)致維生素D結(jié)合蛋 白與維生素D和/或其一種代謝物之間的有效解離。
[0022] 具體地，氟代烷基表面活性劑與醇以如下量使用，該量使得當(dāng)表面活性劑為固體 時(shí)該表面活性劑的重量或當(dāng)其為液體時(shí)該表面活性劑的體積除以醇的體積的百分比比值 在10%至60%的范圍內(nèi)，優(yōu)選在15%至40%的范圍內(nèi)，且更優(yōu)選在15%至30%的范圍內(nèi)。固 體或液體性質(zhì)在環(huán)境溫度下(特別是在22°C下)和在環(huán)境壓力下(特別在1013百帕(hPa))評 估。
[0023] 有利地，氟代烷基表面活性劑選自全氟羧酸、全氟磺酸及其鹽，并且特別選自全氟 己酸、全氟庚酸和全氟辛酸及其鹽。全氟己酸(perfluorohexanoic acid)也稱為全氟羊油 酸(perfluorocaproic acid)或十一氟己酸；其化學(xué)文摘社(CAS)注冊號為307-24一4。全 氣辛酸(perfluorooctanoic acid)也稱為全氣羊脂酸(perfluorocaprylie acid)或十五 氟辛酸;其CAS號為335-67-1?？偟膩碚f，這些全氟代烷酸的鹽是固體，而對應(yīng)的游離酸是 液體。
[0024] 全氟己酸(可呈鹽形式)是優(yōu)選的氟代烷基表面活性劑，因?yàn)槠渑c更長鏈的氟代烷 基表面活性劑相比，顯示出更好的降解度。
[0025]在優(yōu)選的方式中，所用的醇具有1至3個(gè)碳原子，并且選自甲醇、乙醇、正丙醇和異 丙醇。甲醇是本發(fā)明優(yōu)選的醇，因?yàn)槠淇稍诮怆x之后進(jìn)行的測定的結(jié)果再現(xiàn)性方面獲得更 好的表現(xiàn)，并且在改進(jìn)解離和獲得的結(jié)果的再現(xiàn)性方面提供了良好的折中。
[0026]在尤其有利的方式中，解離用全氟己酸和甲醇進(jìn)行。
[0027] 在本發(fā)明的上下文中，解離可以是在額外的表面活性劑的存在下進(jìn)行，所述額外 的表面活性劑特別選自基于氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物、聚山梨醇酯和聚乙二醇 醚。
[0028] 舉例來說，實(shí)施本發(fā)明以從維生素D結(jié)合蛋白解離25-羥基維生素D，并且特別是 25-羥基維生素D2和/或25-羥基維生素D3。
[0029] 醇和氟代烷基表面活性劑可以分別摻入需要獲得解離的樣品中，或它們可以同時(shí) 摻入。在這樣的情況下，使用被稱為"解離"溶液的單個(gè)溶液，以使操作最小化。
[0030] 本發(fā)明還提供了包括至少一種氟代烷基表面活性劑(且特別是全氟代烷基表面活 性劑)和至少一種具有1至4個(gè)碳原子的醇的溶液。
[0031] 這樣的溶液可以被稱為是水性的（aqueous)，并且它們包含大量的水，這通常表示 相對于溶液的總體積占大于80體積％。
[0032]有利地，這樣的溶液包括：
[0033] 當(dāng)表面活性劑為液體時(shí)的體積或當(dāng)其為固體時(shí)的重量相對于溶液的總體積表示 的氟代烷基表面活性劑的百分比在0.1%至3%的范圍內(nèi)，優(yōu)選1%至2%的范圍內(nèi)的表面活 性劑。在同等優(yōu)選的方式中，這樣的溶液包括體積相對于溶液的總體積的百分比在0.5%至 1 〇%的范圍內(nèi)，并且優(yōu)選在2%至7%的范圍內(nèi)的醇。
[0034] 參照用途陳述的涉及醇和氟代烷基表面活性劑的選擇及它們的相對量的相同優(yōu) 選方案適用于本發(fā)明的解離溶液。
[0035] 在有利的變化方案中，本發(fā)明的解離溶液還含有另一種表面活性劑，其選自基于 氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物、聚山梨醇酯和聚乙二醇醚。在試圖不受限于結(jié)果的任 何特定理解的情況下，這樣的額外的表面活性劑可提高待測定的維生素D或其代謝物的溶 解度。這樣的額外的表面活性劑(如Pluronic?F-127,其為對應(yīng)于基于氧化乙烯和氧化丙 烯的嵌段共聚物的多元醇)特別用于提高結(jié)果的再現(xiàn)性。發(fā)現(xiàn)，最終測定更加可靠。通過非 限制性實(shí)例，可以在解離溶液中的優(yōu)選在〇. 1 %至3% (相對于解離溶液的總體積，按體積 計(jì))范圍內(nèi)的濃度使用Pluronic? F-127。
[0036] 通常，本發(fā)明的解離溶液被緩沖，尤其被緩沖至6至8范圍內(nèi)的pH。
[0037] 診斷領(lǐng)域中常規(guī)使用的緩沖液可以被摻入溶液，以獲得所需范圍的pH并且使其穩(wěn) 定。舉例來說，可以使用磷酸緩沖鹽水(PBS)緩沖液或tris緩沖液(三羥甲