基氨基甲烷）。 [0038]可以摻入堿以調(diào)節(jié)pH。這樣的堿可以是出于這一目的常規(guī)使用的任何堿，如Κ0Η、 Na0H、Li0H 或 Na2HP〇4。
[0039] 這樣的解離溶液可以通過(guò)將優(yōu)選濃度范圍在1毫摩爾(mM)至500mM內(nèi)的緩沖液、優(yōu) 選濃度范圍在0.1 %至3 % (相對(duì)于解離溶液的最終體積，根據(jù)表面活性劑的固體或液體性 質(zhì)按重量計(jì)或按體積計(jì)）內(nèi)的氟代烷基表面活性劑以及優(yōu)選濃度范圍在〇. 5 %至10% (相對(duì) 于解離溶液的最終體積，按體積計(jì)）的醇在去離子水中混合來(lái)制備。依據(jù)所選的緩沖液，通 過(guò)加酸或加堿調(diào)節(jié)解離溶液的pH，以獲得范圍在4至8,并且優(yōu)選約7的值。當(dāng)解離溶液含有 額外的表面活性劑時(shí)，其可以在任何階段引入。
[0040] 有利地，這樣的解離溶液不含有任何以下化合物:二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、N， N-二甲基乙酰胺、四甲基脲、N-甲基吡咯烷酮、1，3_二甲基_3,4,5,6_四氫-2(1H)_嘧啶酮、 六甲基磷酸三酰胺。
[0041] 本發(fā)明還提供了體外檢測(cè)并定量生物樣品中的維生素D和/或至少一種維生素D代 謝物的檢測(cè)和定量方法，該方法包括以下步驟：
[0042] a)通過(guò)摻入至少一種氟代烷基表面活性劑和至少一種具有1至4個(gè)碳原子的醇處 理樣品，以從維生素D結(jié)合蛋白解離至少一種氟代烷基表面活性劑和至少一種具有1至4個(gè) 碳原子的醇的步驟；
[0043] b)檢測(cè)并定量維生素D和/或其至少一種代謝物的步驟。
[0044] 解離步驟a)應(yīng)該在檢測(cè)和定量步驟b)之前進(jìn)行。
[0045] 有利地，在這樣的檢測(cè)和定量方法中，步驟a)的處理是通過(guò)將樣品與本發(fā)明的解 離溶液混合來(lái)進(jìn)行的。通常，1至20體積的解離溶液，優(yōu)選5至10體積，更優(yōu)選6至8體積并且 特別是約7體積的溶液用于1體積的樣品。所選的體積是待檢測(cè)的維生素D和/或維生素D代 謝物(稱為待檢測(cè)的分析物)的推測(cè)濃度的函數(shù)。
[0046] 有利地，本發(fā)明的檢測(cè)和定量方法對(duì)血液、血清或血漿樣品實(shí)施。
[0047]檢測(cè)和定量方法特別適合于檢測(cè)并定量25-羥基維生素出和/或25-羥基維生素D3。
[0048] 在步驟b)中，檢測(cè)和定量?jī)?yōu)選通過(guò)進(jìn)行免疫測(cè)定，或甚至通過(guò)質(zhì)譜來(lái)進(jìn)行。
[0049] 本發(fā)明還提供了通過(guò)免疫測(cè)定檢測(cè)維生素D和/或至少一種維生素D代謝物的并包 含本發(fā)明的解離溶液的試劑盒。這樣的試劑盒還包括維生素D或其一種代謝物的結(jié)合對(duì)應(yīng) 物，和/或一個(gè)固相，其上結(jié)合了類似于用于檢測(cè)的維生素D和/或維生素D代謝物的半抗原， 所述半抗原由標(biāo)記的抗體識(shí)別。
[0050]在本發(fā)明的上下文中，維生素D代謝物涵蓋了包含維生素D2骨架或維生素D3骨架的 所有化合物，并且特別是：
[0051] 25-羥基維生素D，其具體是在25位被羥基化的維生素D代謝物，即25-羥基維生素 D2和25-羥基維生素D3;
[0052] 1，25和24,25-二羥基維生素D形式，其具體為分別在1和25位或在24和25位被二羥 基化的維生素D的代謝物。
[0053]在本發(fā)明的使用方法中，解離可通過(guò)在分析樣品中同時(shí)或分別摻入已選擇的氟代 烷基表面活性劑和Q-C4醇(且優(yōu)選(^-(：3醇）來(lái)進(jìn)行。在這樣的摻入后，不需要分離，并且能 夠直接對(duì)所得的樣品進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)選地，為了限制操作，將之前制備的含有已選擇的氟代烷 基表面活性劑和心-心醇(且優(yōu)選&_(： 3醇）的溶液摻入樣品中，并且特別是根據(jù)本發(fā)明的溶 液。
[0054]為了增強(qiáng)解離，使包含已選擇的氟代烷基表面活性劑(并且特別是全氟代烷基表 面活性劑)和心-心醇(且優(yōu)選(^-(：3醇）的樣品經(jīng)受混合?？梢杂萌魏魏线m的裝置進(jìn)行這樣的 混合，并且特別是借助用作移液管的反應(yīng)錐形管（cone)，如申請(qǐng)人的Vidas參技術(shù)（ Vidas?Instrument manual，2005，第2章，F(xiàn)unctional description，2-1至2-16，bioM6 rieux France])。
[0055]可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)檢測(cè)維生素D或其一種代謝物，并且特 別是通過(guò)使用待檢測(cè)的分析物的結(jié)合伴侶進(jìn)行測(cè)試，并且特別是免疫學(xué)測(cè)試(也稱為免疫 測(cè)定測(cè)試)或甚至通過(guò)質(zhì)譜。
[0056]顯然，例如術(shù)語(yǔ)"免疫測(cè)定"中的前綴"免疫"在本發(fā)明中不應(yīng)該被理解為嚴(yán)格表明 結(jié)合伴侶必須是免疫來(lái)源的伴侶(如抗體或抗體片段）。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，這一 術(shù)語(yǔ)更加廣泛地用于指如下測(cè)試和方法，其中結(jié)合對(duì)應(yīng)物不僅僅是免疫來(lái)源和/或免疫性 質(zhì)的伴侶，而且可以例如由待檢測(cè)和/或定量的分析物接受器(receiver)組成，條件是關(guān)注 的結(jié)合伴侶必須能夠結(jié)合到所尋求的分析物，并且優(yōu)選以特異性方式。因此，已知使用術(shù)語(yǔ) "酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Elisa)"用于使用結(jié)合伴侶的測(cè)定，其不是嚴(yán)格意義上地免疫性，并且 更加廣泛地被稱為"配體結(jié)合"測(cè)定，即便是縮寫Elisa中包含了術(shù)語(yǔ)"免疫"。出于清楚和一 致的目的，本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)"免疫"涵蓋了使用適合于與所尋求的分析物結(jié)合并對(duì)其檢 測(cè)和/或定量(優(yōu)選以特異性方式）的至少一種結(jié)合伴侶的任何生物學(xué)分析，即使當(dāng)所述結(jié) 合伴侶不是嚴(yán)格意義上的免疫性質(zhì)或免疫來(lái)源。
[0057] 免疫測(cè)試優(yōu)選是競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，其為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的測(cè)定形式，并且當(dāng)分析物 是半抗原時(shí)使用。免疫測(cè)試在于通過(guò)建立樣品的分析物與分析物的類似物之間的競(jìng)爭(zhēng)而測(cè) 定樣品內(nèi)分析物，特別是維生素D和/或其至少一種代謝物。然后，通過(guò)示蹤物的存在揭示免 疫反應(yīng)。
[0058] 分析物類似物可以在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)中使用，而不需要之前或之后偶聯(lián)到標(biāo)志物，以形 成共輒物或示蹤物。
[0059]通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)的免疫測(cè)定還需要使用分析物的結(jié)合伴侶(partner)，分析物類似物和 分析物相對(duì)于結(jié)合伴侶進(jìn)入競(jìng)爭(zhēng)。當(dāng)分析物類似物沒有偶聯(lián)到標(biāo)志物(其不是示蹤物，而是 捕獲對(duì)應(yīng)物)時(shí)，標(biāo)記結(jié)合伴侶以構(gòu)成反應(yīng)示蹤物。當(dāng)分析物類似物偶聯(lián)到標(biāo)志物(其然后 為示蹤物)時(shí)，結(jié)合伴侶成為捕獲伴侶。
[0060] 因此，所測(cè)量的示蹤物發(fā)出的信號(hào)與樣品中分析物的量成反比。
[0061] 術(shù)語(yǔ)"標(biāo)志物"被用于指含有與捕獲伴侶或分析物類似物反應(yīng)的基團(tuán)的任何分子， 依據(jù)形式，其沒有化學(xué)改性而直接含有這樣的基團(tuán)，或在化學(xué)改性之后以包括這樣的基團(tuán)， 該分子能夠直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。這樣的反應(yīng)性基團(tuán)具體可以是伯胺。這樣的直 接檢測(cè)標(biāo)志物的非限制性列表如下：
[0062] 產(chǎn)生例如通過(guò)比色法、熒光、發(fā)光如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶 和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶可檢測(cè)的信號(hào)的酶；
[0063]發(fā)色團(tuán)，如焚光化合物、發(fā)光（luminescent)化合物和染料化合物；
[0064] 放射性分子，如32P、35S或1251;
[0065]焚光分子，如Alexa或藻青蛋白；和
[0066] 電化學(xué)發(fā)光鹽，如基于吖啶或釕的有機(jī)金屬衍生物。
[0067] 還可以使用間接檢測(cè)系統(tǒng)，例如能夠與抗配體反應(yīng)的配體。然后，配體對(duì)應(yīng)于與分 析物類似物或結(jié)合伴侶作用以構(gòu)成示蹤物的標(biāo)志物。
[0068] 配體/抗配體對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，如應(yīng)用于以下對(duì):生物素/鏈霉親和素、 半抗原/抗體、抗原/抗體、肽/抗體、糖/凝集素、多核苷酸/多核苷酸互補(bǔ)物。
[0069] 然后，抗配體可通過(guò)以上描述的直接檢測(cè)標(biāo)志物直接檢測(cè)，或其自身可以是通過(guò) 使用一些其他配體/抗配體對(duì)可檢測(cè)的，等等。
[0070] 在某些條件下，這些間接檢測(cè)系統(tǒng)可產(chǎn)生被放大的信號(hào)。這些信號(hào)放大技術(shù)是本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可以參照申請(qǐng)人的現(xiàn)有專利申請(qǐng)F(tuán)R 2 781 802或W0 95/08000。
[0071] 依據(jù)所用的標(biāo)志物的類型，本領(lǐng)域技術(shù)人員加入能夠使標(biāo)記被觀察到或能夠發(fā)出 信號(hào)的試劑，所述發(fā)出信號(hào)通過(guò)任何合適類型的測(cè)量設(shè)備可檢測(cè)，例如分光光度計(jì);分光熒 光計(jì);或甚至是高清晰度照相機(jī)。
[0072] 針對(duì)維生素D或其一種代謝物或甚至是多個(gè)這些化合物的術(shù)語(yǔ)"結(jié)合伴侶"被用于 表示能夠與維生素D或其一種代謝物或甚至與若干這些化合物(廣泛而言稱為"維生素D分 析物"）結(jié)合的任何分子。作為維生素D分析物結(jié)合伴侶的實(shí)例，可以提到的有抗體、抗體部 分(antibody fraction)、nanof it ins、維生素 D分析物接受器(receiver)或已知與維生素 D 分析物相互作用的任何其他蛋白。
[0073] 舉例來(lái)說(shuō)，結(jié)合伴侶抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。
[0074] 可以通過(guò)用目標(biāo)維生素D分析物作為免疫原免疫動(dòng)物，隨后通過(guò)從所述動(dòng)物獲取 血清并從血清的其他組分分離出所述抗原(特別是通過(guò)在其上固定有抗體特異性識(shí)別的抗 原(特別是免疫原）的柱上進(jìn)行的親和色譜)來(lái)回收純形式的所尋求的抗體，從而獲得多克 隆抗體。
[0075] 可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的雜交瘤技術(shù)獲得單克隆抗體。單克隆抗體也可以 是通過(guò)基因工程，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)獲得的重組抗體。
[0076] 作為抗體片段的實(shí)例，可以提到的有?&13、？&13'、？( &13'）2以及單鏈可變片段(8(^4 和雙鏈可變片段(dsFv)。這些功能片段可以具體通過(guò)基因工程獲得。
[0077] Nanofitins(商標(biāo)名）是小的蛋白質(zhì)，類似于抗體，其能夠結(jié)合到生物靶，從而可在 生物體內(nèi)檢測(cè)所述生物靶、捕獲所述生物靶或僅僅靶向所述生物靶。
[0078] 所用的結(jié)合伴侶相對(duì)于維生素D分析物可以是特異性的或非特異性的。當(dāng)它們能 夠以排他或幾乎排他方式與維生素D分析物結(jié)合時(shí)，它們被稱為"特異性的"。當(dāng)它們與維生 素D分析物結(jié)合的選擇性弱，從而使它們還能夠與其他配體(如其他蛋白質(zhì)或抗體)結(jié)合時(shí)， 它們被稱為"非特異性的"。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選特異性結(jié)合伴侶。
[0079]抗維生素D分析物抗體是已知的，并且它們具體被描述在Hollis，Cli