(或者至少被認(rèn)為處于相同位置）。因此，通過(guò)比較顆粒從阻滯脈沖上的任何一致的 已定義點(diǎn)到達(dá)該點(diǎn)所花費(fèi)的時(shí)間，可W直接導(dǎo)出運(yùn)些顆粒的相對(duì)速度。
[0027] 在凈壓力和電壓偏置下行經(jīng)孔隙的顆粒將具有=個(gè)速度分量：
[00%] 1、對(duì)流一一壓力驅(qū)動(dòng)的流體流動(dòng)將隨之?dāng)y帶顆粒
[0029] 2、電泳--顆粒電荷將導(dǎo)致顆粒朝向電性相反的電極移動(dòng)經(jīng)過(guò)周?chē)牧黧w
[0030] 3、電滲透一一孔隙隔膜的表面電荷(其通常是負(fù)的）吸引更高密度的電性相反的 (其通常是正的）離子存在于孔隙的附近。運(yùn)些正離子朝向負(fù)電極移動(dòng)，并且隨之?dāng)y帶水分 子從而產(chǎn)生流體的"活塞流(plug flow)"。
[0031] 通常來(lái)說(shuō)，僅有電泳分量將基于表面電荷在顆粒之間變化。本發(fā)明提供了運(yùn)樣一 種方法，其將顆粒速度解析成所述=個(gè)分量，并且通過(guò)把所測(cè)量的電泳速度與具有已知表 面電荷的校準(zhǔn)顆粒的電泳速度進(jìn)行比較而導(dǎo)出未知顆粒的表面電荷。
[0032] 對(duì)于相同實(shí)驗(yàn)條件下的任何兩個(gè)顆粒，當(dāng)相對(duì)阻滯量值相同時(shí)，傳感器內(nèi)的有效 顆粒位置將是相同的。因此，對(duì)于由具有未知表面電荷K電位)的顆粒生成的電阻脈沖，所 測(cè)量的速度連同從校準(zhǔn)顆粒導(dǎo)出的已知的對(duì)流和電滲透分量被用來(lái)計(jì)算所測(cè)量的顆粒的 電泳速度。隨后通過(guò)把該所測(cè)量的電泳速度與具有已知表面電荷a電位）的校準(zhǔn)顆粒進(jìn)行 比較來(lái)計(jì)算顆粒表面電荷K電位）。
[0033] 運(yùn)種新穎方法的長(zhǎng)處在于其簡(jiǎn)單性。所述方法不需要關(guān)于傳感器的幾何結(jié)構(gòu)的任 何先前的知識(shí)，所述幾何結(jié)構(gòu)在商業(yè)的基礎(chǔ)上測(cè)量起來(lái)過(guò)于昂貴并且耗時(shí)（利用電子顯微 鏡檢查或類(lèi)似方法）。純粹地基于電阻脈沖量值和形狀，簡(jiǎn)單地針對(duì)已知的顆粒集合來(lái)校準(zhǔn) 每一個(gè)單獨(dú)的未知物體的相對(duì)電泳速度，并且所需的時(shí)間和處理能力是最小的。
[0034] 運(yùn)種電荷測(cè)量方法在W下條件下會(huì)最佳地工作：
[0035] -將要測(cè)量的物體懸浮在電解液中，其濃度允許測(cè)量多個(gè)物體（為了操作人員方 便，理想地在幾分鐘的時(shí)間段內(nèi)）。
[0036] -將要測(cè)量的物體小于感測(cè)區(qū)域W避免阻滯。
[0037] -電流的采樣頻率快到足W在每一個(gè)脈沖上捕獲若干數(shù)據(jù)點(diǎn)。如果采樣頻率對(duì)于 特定設(shè)置過(guò)于緩慢，可W通過(guò)在孔隙上施加壓力差或者調(diào)節(jié)(甚至反轉(zhuǎn))所施加的偏置電壓 來(lái)放慢脈沖。
[0038] -脈沖的信噪比大到足W能夠W良好的準(zhǔn)確度測(cè)量參考感興趣點(diǎn)。如果信噪比過(guò) 小，則可W通過(guò)增大所施加的偏置電壓W及(對(duì)于靈活的孔隙)減小傳感器的尺寸來(lái)增大信 號(hào)。
[0039] -電泳占到作用在所測(cè)量的物體(特別是校準(zhǔn)顆粒)上的總的力當(dāng)中的很高比例。 運(yùn)通?？蒞通過(guò)增大偏置電壓W及減小壓力差來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0040] 對(duì)于具有孔隙的真實(shí)生活樣本的測(cè)量，特別是生物派生的樣本，可能存在若干復(fù) 雜化因素。運(yùn)些復(fù)雜化因素包括：
[0041] i)樣本顆粒(或者樣本流體的其他成分)基于相反的極性結(jié)合到孔隙上。
[0042] ii)樣本顆粒(或者樣本流體的其他成分)到孔隙的非特異性結(jié)合。運(yùn)些情形當(dāng)中 的任一種都可能導(dǎo)致隔膜的C電位Cm的改變，從而預(yù)期將會(huì)直接影響對(duì)應(yīng)于每一個(gè)樣本顆 粒的絕對(duì)C電位的計(jì)算數(shù)值。
[0043] 在孔隙被帶電顆?；蛏锓肿?比如蛋白質(zhì)或DNA)涂覆的情況下，孔隙C電位可能 會(huì)改變并且影響電滲透。對(duì)孔隙C電位進(jìn)行評(píng)估，W便準(zhǔn)確地測(cè)量顆粒C電位?？蒞利用對(duì)孔 隙施加的可變外部壓力通過(guò)流動(dòng)電位測(cè)量在原位確定孔隙C電位。通過(guò)施加某種程度上的 可變外部壓力，液體經(jīng)過(guò)孔隙的移動(dòng)產(chǎn)生流動(dòng)電位和流動(dòng)電流。通過(guò)考慮到孔隙的幾何結(jié) 構(gòu)，從流動(dòng)電位與壓力斜率的關(guān)系計(jì)算孔隙C電位。
[0044] 當(dāng)在電阻脈沖傳感器中監(jiān)測(cè)化學(xué)和/或生物反應(yīng)時(shí)，對(duì)于孔隙C電位的該原位測(cè)量 是有用的。不同的生物系統(tǒng)可能會(huì)W非常不同的方式影響孔隙，在測(cè)量生物樣本之前和之 后檢查孔隙的C電位允許檢測(cè)和量化運(yùn)些改變。
[0045] 補(bǔ)償運(yùn)種結(jié)合效應(yīng)的另一種方法是通過(guò)將校準(zhǔn)顆粒(其具有已知的C電位)添加到 樣本流體中，隨后將在對(duì)于樣本完全相同的條件下對(duì)其進(jìn)行測(cè)量。運(yùn)種方法可W提供絕對(duì) 表面電荷測(cè)量，即使孔隙的誠(chéng)位已經(jīng)例如被外來(lái)體、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)、核酸適體(aptamer)、 DNA、RNA或者任何其他試劑所修改。運(yùn)種方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，如果孔隙特性在分析期間 和/或作為分析的結(jié)果發(fā)生改變，則校準(zhǔn)顆?？蒞被用來(lái)解決分析過(guò)程中的改變，并且提供 正確的樣本測(cè)量。通過(guò)添加分別具有不同的已知C電位的多個(gè)校準(zhǔn)顆粒集合可W增強(qiáng)運(yùn)種 方法。
[0046] 應(yīng)對(duì)與結(jié)合效應(yīng)相關(guān)聯(lián)的問(wèn)題的另一種方法是通過(guò)對(duì)孔隙進(jìn)行表面處理來(lái)防止 結(jié)合。運(yùn)可W包括利用防污試劑對(duì)孔隙表面進(jìn)行永久性涂覆。或者，所述應(yīng)對(duì)可W設(shè)及緊接 在測(cè)量之前把"阻斷劑(blocking agent)"添加到孔隙，其結(jié)合到孔隙的表面上的所有可用 附著位點(diǎn)，并且對(duì)于校準(zhǔn)和樣本測(cè)量的持續(xù)時(shí)間給出已知的穩(wěn)定C電位。使用阻斷劑的一個(gè) 優(yōu)點(diǎn)在于，阻斷劑可W被匹配W便適應(yīng)不同的樣本顆粒類(lèi)型和載體流體。
[0047] 在權(quán)利要求書(shū)中闡述了本發(fā)明的各個(gè)方面。
【附圖說(shuō)明】
[0048] 圖1是對(duì)應(yīng)于一般錐形孔徑的從W相同速度行進(jìn)的更大和較小顆粒得到的阻滯形 狀的示意性比較。
[0049] 圖2是對(duì)應(yīng)于不同孔徑形狀的從W相同速度行進(jìn)的更大和較小顆粒得到的阻滯形 狀的示意性比較。
[0050] 圖3是對(duì)應(yīng)于校準(zhǔn)顆粒的平均(Vx)tot(即1/Tx)與偏置電壓V的關(guān)系的曲線圖（實(shí) 例1)。
[0051 ] 圖4是對(duì)應(yīng)于校準(zhǔn)顆粒的作為dR max的百分比的函數(shù)從dR max的10%到40%所計(jì) 算的(Vx)C的曲線圖（實(shí)例1)。
[0052] 圖5是對(duì)應(yīng)于多個(gè)所施加的壓力的C電位與尺寸的關(guān)系的曲線圖，其中示出了可重 復(fù)的結(jié)果。
[0053] 圖6是對(duì)應(yīng)于多個(gè)所施加的偏置電壓的C電位與尺寸的關(guān)系的曲線圖，其中示出了 可重復(fù)的結(jié)果。
[0054] 圖7是對(duì)應(yīng)于高度帶電（簇化)和帶電程度較低(普通）的PS顆粒的C電位與尺寸的 關(guān)系的曲線圖。
[0055] 圖8是C電位與尺寸的關(guān)系的曲線圖，其中示出了通過(guò)檢測(cè)C電位的改變來(lái)檢測(cè)脂 質(zhì)體的表面修改。
[0056] 圖9是C電位與尺寸的關(guān)系的曲線圖，其中示出了對(duì)于"添加（spiked)"有簇化校準(zhǔn) 顆粒的脂質(zhì)體的懸浮液的測(cè)量。
【具體實(shí)施方式】
[0057] 本發(fā)明的某些實(shí)施例設(shè)及使用在W02013017671中公開(kāi)的設(shè)備，其全部?jī)?nèi)容被合并 在此W作參考。
[0058] 在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，利用了形成在不可滲透的隔膜中的具有固定或可變幾 何結(jié)構(gòu)的納米孔隙或微孔隙。該孔隙的確切的幾何結(jié)構(gòu)和規(guī)格可W是已知的，但是所述孔 隙的確切幾何結(jié)構(gòu)和規(guī)格通常將是未知的。
[0059] 所述隔膜被裝配到設(shè)備中，其允許把電解液的阱(或膽液器或腔室)放置在隔膜的 任一側(cè)一一各個(gè)阱只通過(guò)孔隙本身彼此連接。在一種形式中，所述孔徑或孔隙可W被提供 作為薄板中的（小)孔桐，所述薄板形成兩個(gè)腔室之間的（部分)壁面，從而把所述腔室彼此 分開(kāi)。所述設(shè)備包含與每一個(gè)電解液阱接觸的至少一個(gè)電極，從而可W孔隙上施加用戶(hù)定 義的偏置電壓，并且可W監(jiān)測(cè)所得到的流過(guò)孔隙的電流。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，可W替 換地施加流經(jīng)孔隙的用戶(hù)定義的電流，并且可W監(jiān)測(cè)所得到的孔隙上的電壓。
[0060] 所述設(shè)備包括用于改變施加到任一個(gè)或全部?jī)蓚€(gè)電解液阱的壓力的裝置，從而可 W在孔隙上的任一個(gè)方向上施加用戶(hù)定義的差分壓力(Pap),從而得到電解液從一個(gè)阱到 另一個(gè)的對(duì)流流動(dòng)或者反之亦然。
[0061] 由于重力和/或表面張力導(dǎo)致的系統(tǒng)的固有壓頭(Pin)是已知的，并且在(通常使 用相同體積的流體實(shí)現(xiàn)的)各項(xiàng)測(cè)量之間是一致的。
[0062] 經(jīng)過(guò)用于分析的孔隙的物體可W由任何材料構(gòu)成，其中包括固體(例如碳、二氧化 娃、聚合物、金屬）、生物顆粒(例如病毒、細(xì)菌、微泡、脂質(zhì)體、細(xì)胞）、液體(例如乳狀液)或者 氣體(例如納米氣泡）。在優(yōu)選的形式中，使用固體校準(zhǔn)顆粒(例如簇化聚苯乙締）。因此，穿 過(guò)孔隙的物體在后面被稱(chēng)作"顆粒"。
[0063] 所述方法允許對(duì)改動(dòng)顆粒C電位的顆粒表面上的化學(xué)/生物化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行量化測(cè) 量。檢測(cè)顆粒C電位中的運(yùn)種改變的能力構(gòu)成基于孔隙的診斷化驗(yàn)的基礎(chǔ)。表面反應(yīng)可W包 括核酸適體、蛋白質(zhì)、抗體、凝集素、DNA、RNA、其他化學(xué)或生物化學(xué)試劑到顆粒表面的特異 性結(jié)合。所述顆?？蒞包括細(xì)胞、細(xì)胞外囊泡、亞細(xì)胞絡(luò)合物、脂質(zhì)體、合成顆粒，但是不限 于此?？蒞通過(guò)在適當(dāng)?shù)臈l件下利用表面改性劑培育顆粒一段時(shí)間之前和之后的顆粒C電 位的比較測(cè)量來(lái)對(duì)反應(yīng)進(jìn)行量化，或者可W實(shí)時(shí)地連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程。
[0064] 當(dāng)每一個(gè)顆粒穿過(guò)孔隙時(shí)，存在所得到的電阻脈沖或"阻滯"。對(duì)于具有較小高寬 比的（在很大程度上是球形的）物體，任何給定的阻滯的一般形狀由孔隙的形狀決定;取決 于每一個(gè)顆粒的尺寸和速度，該一般形狀在量值(高度)和持續(xù)時(shí)間（寬度)方面被"拉伸"。
[0065] 圖1示出了更大的顆粒（圖1的上半部分)和較小的顆粒（圖1的下半部分）W相同的 速度行經(jīng)孔隙的經(jīng)過(guò)，其中相應(yīng)的電阻與時(shí)間關(guān)系曲線圖示出了所得到的阻滯形狀。
[0066] 所述方法識(shí)別出信號(hào)跡線中的最大電阻點(diǎn)（阻滯峰值），其在優(yōu)選的孔隙設(shè)置中靠 近阻滯的開(kāi)頭。對(duì)于每一項(xiàng)阻滯，所述峰值發(fā)生的時(shí)間被定義成tiooQOO%峰值量值處的時(shí) 間），并且脈沖的最大量值(相對(duì)于局部基線電阻)被記錄為dR max。
[0067] 在最簡(jiǎn)單的實(shí)施例中，阻滯被劃分成V'個(gè)節(jié)段，并且對(duì)于每一個(gè)節(jié)段記錄從tioo 算起的持續(xù)時(shí)間。在圖1所示出的實(shí)例中存在n = 4個(gè)節(jié)段：dR max的40 %、30 %、20 %和 10%。從tlOO至Ij運(yùn)些節(jié)段當(dāng)中的每一個(gè)的持續(xù)時(shí)間被定義在t40、t30、t20和tlO處。
[0068] 通過(guò)利用對(duì)應(yīng)于每一項(xiàng)阻滯的相對(duì)量值進(jìn)行工作，可W從電荷分析計(jì)算中消除