本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及FFPE樣本拷貝數(shù)變異檢測裝置及檢測方法。

背景技術(shù)：

福爾馬林固定石蠟包埋(Formalin-fixed and Paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)方法制備的組織標(biāo)本稱為福爾馬林固定石蠟包埋組織樣本，簡稱FFPE樣本。FFPE樣本能夠長時間保存，特別是，有大量的腫瘤組織切片被以FFPE樣本的形式保存。FFPE樣本常用于臨床病理檢驗(yàn)、腫瘤基因檢測和醫(yī)學(xué)科學(xué)研究，為闡明疾病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)治療靶標(biāo)和指示預(yù)后等方面提供了寶貴的資源。

基因的拷貝數(shù)變異(Copy Number Variation，CNV)是一類在臨床上非常重要的結(jié)構(gòu)變異，與多種腫瘤的預(yù)后，靶向藥物的敏感性相關(guān)?？煽康腃NV檢測結(jié)果可以為臨床用藥以及病情評估等提供十分重要的依據(jù)。目前臨床上所使用的CNV檢測技術(shù)大多為基于PCR或免疫組化的實(shí)驗(yàn)手段(如FISH，IHC等)。此類方法單次檢測僅可覆蓋一個基因，且檢測結(jié)果靈敏度較低。

基于新一代測序(Next-Generation Sequencing，NGS)平臺的CNV檢測，可以在保證檢測性能的前提下一次性給出多個基因的CNV檢測結(jié)果。傳統(tǒng)的NGS平臺CNV檢測技術(shù)大多基于全基因組測序技術(shù)平臺完成研發(fā)，隨著NGS技術(shù)的不斷進(jìn)步，基于目標(biāo)區(qū)域捕獲的高深度測序技術(shù)在臨床檢測的應(yīng)用場景下逐漸表現(xiàn)出優(yōu)勢。

但是，由于全基因組測序數(shù)據(jù)與目標(biāo)區(qū)域捕獲測序數(shù)據(jù)存在根本差別，目前傳統(tǒng)NGS平臺的CNV檢測方法對于目標(biāo)區(qū)域捕獲測序數(shù)據(jù)并不適用，在檢測CNV的準(zhǔn)確性上難以保證，且檢測靈敏度有待提高。這一問題在FFPE樣本中表現(xiàn)尤為明顯。FFPE樣本的DNA片段化較為嚴(yán)重，會對目標(biāo)基因DNA捕獲以及NGS測序等過程產(chǎn)生影響，并最終影響到目標(biāo)區(qū)域的有效深度等關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)。因此，低質(zhì)量FFPE樣本所產(chǎn)生的低深度測序數(shù)據(jù)的可用性，成為了較大的技術(shù)挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種對FFPE樣本的CNV的檢測靈敏度更高的檢測裝置及檢測方法。

本發(fā)明的發(fā)明人為解決上述技術(shù)問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在FFPE樣本的CNV檢測方法中，是否對數(shù)據(jù)進(jìn)行合理的降噪處理，是否使用了合適的背景庫，會直接影響到檢測結(jié)果，特別是在捕獲測序中此種影響尤為顯著。通過更為合理全面的降噪處理，動態(tài)背景庫的應(yīng)用，能夠提高FFPE樣本CNV檢測的靈敏度，從而完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明包括：

一種用于FFPE樣本拷貝數(shù)變異(所述拷貝數(shù)變異可以發(fā)生在基因區(qū)域，也可以發(fā)生在非基因區(qū)域)檢測的裝置，其包括：

測序數(shù)據(jù)獲取模塊，用于獲取來自待檢FFPE樣本的捕獲測序數(shù)據(jù)以及來自健康人群樣本的測序數(shù)據(jù)，所述健康人群樣本為多個健康人(健康正常人)樣本；

序列比對模塊，其與所述測序數(shù)據(jù)獲取模塊連接，用于將所述測序數(shù)據(jù)獲取模塊獲得的測序數(shù)據(jù)與參考基因組序列進(jìn)行比對，得到比對結(jié)果(包含例如，每條可以與參考基因組比對上的短序列所在的染色體，坐標(biāo)，短序列與參考基因組的匹配情況等信息)，根據(jù)該比對結(jié)果計算每一個位點(diǎn)(指基因組上的每個位點(diǎn)，但捕獲測序中可能有一些位點(diǎn)的深度值為0)的深度值；

前期數(shù)據(jù)處理模塊，其與所述序列比對模塊連接，用于將目標(biāo)區(qū)域(100k～100M，全基因組或者重點(diǎn)關(guān)注區(qū)域)劃分為一定長度(50～1000bp)的有重疊(10～70％)的窗口，去掉窗口內(nèi)位點(diǎn)的深度極值(極大值和極小值)并計算深度均值或中值，且計算該窗口內(nèi)的參考基因組序列的GC含量；

歸一化模塊，其與所述前期數(shù)據(jù)處理模塊連接，用于對所述前期數(shù)據(jù)處理模塊所得到的每一個窗口內(nèi)的深度均值或中值進(jìn)行歸一化，計算得到待檢FFPE樣本和健康人群樣本每個窗口內(nèi)的Z值；

背景庫篩選模塊，其與所述歸一化模塊連接，用于根據(jù)待檢FFPE樣本與健康人群樣本的Z值，篩選出n個健康人樣本(每個健康人樣本對應(yīng)一個健康人)，得到n個健康人樣本的背景庫樣本集，然后使用該n個健康人樣本在m個窗口內(nèi)的Z值構(gòu)建m行n列的矩陣X_m×n；

數(shù)據(jù)波動消除模塊，其與所述背景庫篩選模塊連接，用于消除捕獲測序帶來的固有數(shù)據(jù)波動；

GC校正模塊，其與所述數(shù)據(jù)波動消除模塊連接，用于根據(jù)各窗口內(nèi)的GC含量進(jìn)行GC矯正；

輸出模塊，其與所述GC校正模塊連接，用于輸出CNV檢測結(jié)果(包括例如，用于展示CNV檢測結(jié)果的圖，CNV變異的陰性/陽性的判定結(jié)果等)。

本發(fā)明的用于FFPE樣本拷貝數(shù)變異檢測的裝置的測序數(shù)據(jù)獲取模塊獲取采用二代測序方法對待檢FFPE樣本中的DNA進(jìn)行測序而得到的測序數(shù)據(jù)。二代測序的主流平臺一般均采用邊合成邊測序(Sequencing By Synthesis,SBS)技術(shù)進(jìn)行核酸測序。測序前，需要對核酸(DNA或RNA)樣本進(jìn)行測序文庫的構(gòu)建，基本流程如下：首先將片段化后的DNA進(jìn)行片段的末端修復(fù)，之后在修復(fù)后的片段3'端加“A”堿基，然后將上述DNA片段與含有測序引物結(jié)合位點(diǎn)的DNA接頭(Adapter)連接，最后通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，完成測序文庫構(gòu)建。對于具體的二代測序方法沒有特殊限制，可以采用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的二代測序方法。

優(yōu)選地，所述測序數(shù)據(jù)是采用捕獲測序方法獲得的測序數(shù)據(jù)；

所述捕獲測序的目標(biāo)基因可以因不同的目標(biāo)疾病而異。所述目標(biāo)疾病可以是例如實(shí)體癌(例如胃癌、乳腺、結(jié)腸直腸癌、肺癌等)。

具體例如，在所述目標(biāo)疾病是乳腺癌的情況下，所述目標(biāo)基因可以是例如EGFR基因、ERBB2基因、FGFR1基因、KIT基因、PIK3CA基因或/和PTEN基因；在所述目標(biāo)疾病是結(jié)腸直腸癌的情況下，所述目標(biāo)基因可以是例如EGFR基因、ERBB2基因、FGFR2基因、KRAS基因、MET基因、PTEN基因；在所述目標(biāo)疾病是胃癌的情況下，所述目標(biāo)基因可以是例如EGFR基因、ERBB2基因、FGFR1基因、FGFR2基因、KRAS基因、MET基因、PIK3CA基因或/和PTEN基因；在所述目標(biāo)疾病是肺癌的情況下，所述目標(biāo)基因可以是例如ALK基因、BRAF基因、EGFR基因、ERBB2基因、FGFR1基因、KRAS基因、MET基因、PIK3CA或/和PTEN。

優(yōu)選地，所述前期數(shù)據(jù)處理模塊采用滑動窗口法劃分所述窗口。

優(yōu)選地，所述歸一化模塊依據(jù)下述公式(1)計算得到待檢樣本每個窗口內(nèi)的Z值，公式(1)中Zi表示第i個窗口的Z值，

Z_i＝trimScale(Z_i,Z_i)……(1)。

優(yōu)選地，定義公式(2)：

定義

其中，chr表示染色體，St表示待檢生物樣本，S_N表示健康人群樣本；

所述背景庫篩選模塊根據(jù)待檢FFPE樣本與健康人群樣本的Z值，篩選出使得所述d值最小的n個健康人樣本，得到篩選后的背景庫樣本集S₁,S₂,S₃,…,S_n(N和n均為自然數(shù)且n＜N)。

優(yōu)選地，所述數(shù)據(jù)波動消除模塊對背景庫矩陣X_m×n做奇異值分解，得到m行r列因子矩陣U_m×r，r為因子個數(shù)，然后取貢獻(xiàn)率最大的k個因子(即排名靠前的k個因子，k一般為4-10)進(jìn)行LOESS回歸，得到殘差Z_p。

優(yōu)選地，所述GC校正模塊根據(jù)各窗口內(nèi)的GC含量，對Z_p基于LOESS回歸做GC矯正，得到殘差Z_pg。

優(yōu)選地，所述FFPE樣本拷貝數(shù)變異檢測裝置還包括：

數(shù)據(jù)質(zhì)檢模塊，其與所述測序模塊和所述序列比對模塊連接，用于對所述測序模塊獲得的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)檢。質(zhì)檢包括但不限于例如去除低質(zhì)量的短序列、去除N含量較高的短序列、去除與Adapter相關(guān)的短序列、并最終統(tǒng)計各項相關(guān)的質(zhì)控指標(biāo)。

此外，本發(fā)明還包括：

一種用于FFPE樣本拷貝數(shù)變異(所述拷貝數(shù)變異可以發(fā)生在基因區(qū)域，也可以發(fā)生在非基因區(qū)域)檢測的方法，其包括：

測序數(shù)據(jù)獲取步驟，獲取來自待檢FFPE樣本的捕獲測序數(shù)據(jù)以及來自健康人群樣本的測序數(shù)據(jù)，所述健康人群樣本為多個健康人樣本；

序列比對步驟，將所述測序數(shù)據(jù)獲取步驟獲得的測序數(shù)據(jù)與參考基因組序列進(jìn)行比對，得到比對結(jié)果(包含例如，每條可以與參考基因組比對上的短序列所在的染色體，坐標(biāo)，短序列與參考基因組的匹配情況等信息)，根據(jù)該比對結(jié)果計算每一個位點(diǎn)(指基因組上的每個位點(diǎn)，但捕獲測序中可能有一些位點(diǎn)的深度值為0)的深度值；

前期數(shù)據(jù)處理步驟，將目標(biāo)區(qū)域(100k～100M，全基因組或者重點(diǎn)關(guān)注區(qū)域)劃分為一定長度(50～1000bp)的有重疊(10～70％)的窗口，去掉窗口內(nèi)位點(diǎn)的深度極值(極大值和極小值)并計算深度均值或中值，且計算該窗口內(nèi)的參考基因組序列的GC含量；

歸一化步驟，對前期數(shù)據(jù)處理步驟所得到的每一個窗口內(nèi)的深度均值或中值進(jìn)行歸一化，計算得到待檢FFPE樣本和健康人群樣本每個窗口內(nèi)的Z值；

背景庫篩選步驟，根據(jù)待檢FFPE樣本與健康人群樣本的Z值，篩選出n個健康人樣本(健康人樣本，每個背景庫樣本對應(yīng)一個健康人)，得到背景庫樣本集，然后使用該n個健康人樣本在m個窗口內(nèi)的Z值構(gòu)建m行n列的矩陣X_m×n；

數(shù)據(jù)波動消除步驟，消除捕獲測序帶來的固有數(shù)據(jù)波動；

GC校正步驟，根據(jù)各窗口內(nèi)的GC含量進(jìn)行GC矯正；以及

輸出步驟，輸出CNV檢測結(jié)果(包括例如，用于展示CNV檢測結(jié)果的圖，CNV變異的陰性/陽性的判定結(jié)果等)。

本發(fā)明的用于FFPE樣本拷貝數(shù)變異檢測的方法的測序數(shù)據(jù)獲取步驟獲取采用二代測序方法對待檢FFPE樣本中的DNA進(jìn)行測序而得到的測序數(shù)據(jù)。二代測序的主流平臺一般均采用邊合成邊測序(Sequencing By Synthesis,SBS)技術(shù)進(jìn)行核酸測序。測序前，需要對核酸(DNA或RNA)樣本進(jìn)行測序文庫的構(gòu)建，基本流程如下：首先將片段化后的DNA進(jìn)行片段的末端修復(fù)，之后在修復(fù)后的片段3'端加“A”堿基，然后將上述DNA片段與含有測序引物結(jié)合位點(diǎn)的DNA接頭(Adapter)連接，最后通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，完成測序文庫構(gòu)建。對于具體的二代測序方法沒有特殊限制，可以采用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的二代測序方法。

優(yōu)選地，所述測序數(shù)據(jù)是采用捕獲測序方法獲得的測序數(shù)據(jù)；

所述捕獲測序的目標(biāo)基因可以因不同的目標(biāo)疾病而異。所述目標(biāo)疾病可以是例如實(shí)體癌(例如胃癌、乳腺、結(jié)腸直腸癌、肺癌等)。

具體例如，在所述目標(biāo)疾病是乳腺癌的情況下，所述目標(biāo)基因可以是例如EGFR基因、ERBB2基因、FGFR1基因、KIT基因、PIK3CA基因或/和PTEN基因；在所述目標(biāo)疾病是結(jié)腸直腸癌的情況下，所述目標(biāo)基因可以是例如EGFR基因、ERBB2基因、FGFR2基因、KRAS基因、MET基因、PTEN基因；在所述目標(biāo)疾病是胃癌的情況下，所述目標(biāo)基因可以是例如EGFR基因、ERBB2基因、FGFR1基因、FGFR2基因、KRAS基因、MET基因、PIK3CA基因或/和PTEN基因；在所述目標(biāo)疾病是肺癌的情況下，所述目標(biāo)基因可以是例如ALK基因、BRAF基因、EGFR基因、ERBB2基因、FGFR1基因、KRAS基因、MET基因、PIK3CA或/和PTEN。

優(yōu)選地，所述前期數(shù)據(jù)處理步驟采用滑動窗口法劃分所述窗口。

優(yōu)選地，所述歸一化步驟依據(jù)下述公式(1)計算得到待檢樣本每個窗口內(nèi)的Z值，公式(1)中Zi表示第i個窗口的Z值，

Z_i＝trimScale(Z_i,Z_i)……(1)。

優(yōu)選地，定義公式(2)：

定義

其中，chr表示染色體，S_T表示待檢FFPE樣本，S_N表示健康人群樣本；

所述背景庫篩選步驟根據(jù)待檢FFPE樣本與健康人群樣本的Z值，篩選出使得所述d值最小的n個健康人樣本，得到篩選后的背景庫樣本集S₁,S₂,S₃,…,S_n(N，n均為自然數(shù)且n＜N)。

優(yōu)選地，所述數(shù)據(jù)波動消除步驟對背景庫矩陣X_m×n做奇異值分解，得到m行r列因子矩陣U_m×r，r為因子個數(shù)，然后取貢獻(xiàn)率最大的k個因子(即排名靠前的k個因子，k一般為4-10)進(jìn)行LOESS回歸，得到殘差Z_p。

優(yōu)選地，所述GC校正步驟根據(jù)各窗口內(nèi)的GC含量，對Z_p基于LOESS回歸做GC矯正，得到殘差Z_pg。

優(yōu)選地，所述拷貝數(shù)變異檢測方法還包括：

數(shù)據(jù)質(zhì)檢步驟，對所述測序步驟獲得的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)檢。質(zhì)檢包括但不限于例如去除低質(zhì)量的短序列、去除N含量較高的短序列、去除與Adapter相關(guān)的短序列、并最終統(tǒng)計各項相關(guān)的質(zhì)控指標(biāo)。

其中，上述各步驟的優(yōu)選實(shí)施方式可參照前述。

根據(jù)本發(fā)明，提供一種對FFPE樣本CNV的檢測靈敏度更高的檢測裝置及檢測方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的用于FFPE樣本拷貝數(shù)變異檢測的裝置的示意圖。

圖2為實(shí)施例1對乳腺癌多個基因的CNV檢測結(jié)果的圖。

發(fā)明的具體實(shí)施方式

本說明書中提及的科技術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義，如有沖突以本說明書中的定義為準(zhǔn)。

定義

參考基因組：一個細(xì)胞或者生物體所攜帶的一套完整的單倍體序列，包括全套基因和間隔序列。

比對：一般指序列比對，指為確定兩個或多個序列之間的相似性以至于同源性，而將它們按照一定的規(guī)律排列的過程。

深度值：對于基因組上的某個位點(diǎn)，根據(jù)比對結(jié)果，覆蓋到該位點(diǎn)的短序列數(shù)量即為該位點(diǎn)的深度值。

窗口(滑動窗口)：一般指基因組上的一段固定長度的區(qū)域。

背景庫：由多例(一般認(rèn)為≥20例)健康人樣本所組成的樣本庫。

捕獲測序：通過預(yù)先設(shè)計好的探針，對基因組上的特定區(qū)域(感興趣的區(qū)域)進(jìn)行DNA片段抓取，并最終對抓取到的DNA片段進(jìn)行NGS測序的過程。

NGS(高通量測序)：高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing)又稱“下一代”測序技術(shù)("Next-generation"sequencing technology)，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。

歸一化(Z值)：

trimScale(w,v)：定義w為某個需要進(jìn)行歸一化的值，v為某個數(shù)據(jù)集

a.去掉v上下一定百分比的數(shù)據(jù)得到

b.計算的均值μ和標(biāo)準(zhǔn)差σ

c.計算得到作為最終結(jié)果

SVD(奇異值分解)：SVD是線性代數(shù)中一種重要的矩陣分解，是矩陣分析中正規(guī)矩陣酉對角化的推廣。在信號處理、統(tǒng)計學(xué)等領(lǐng)域有重要應(yīng)用。其作用是把數(shù)據(jù)集映射到低維空間中去。數(shù)據(jù)集的特征值(在SVD中用奇異值表征)按照重要性排列，降維的過程就是舍棄不重要的特征向量的過程，而剩下的特征向量組成的空間即為降維后的空間。

實(shí)施例

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的實(shí)施例是用于解釋本發(fā)明，而非用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

采用本發(fā)明的用于FFPE樣本拷貝數(shù)變異檢測的裝置對一例女性乳腺癌患者的組織FFPE樣本的CNV情況進(jìn)行檢測。

1.1提取FFPE樣本的DNA

采用GeneRead DNA FFPE Kit(QIAGEN公司)，按照手冊說明進(jìn)行提取操作，得到FFPE樣本DNA。

1.2樣本打斷

使用Biorupter打斷儀器進(jìn)行打斷，設(shè)定打斷條件30個循環(huán)，30s ON/30s OFF，將FFPE樣本DNA打斷成200bp左右的片段，得到打斷后的DNA片段。

1.3末端修復(fù)(End Repair)

(1)預(yù)先從-20℃保存的試劑盒中取出所需試劑，單個樣本配制量參見表1。

表1

(2)末端修復(fù)反應(yīng)：加入DNA樣本后將1.5mL離心管置于Thermomixer中20℃溫浴30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后使用1.8×核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，溶于32μLEB。

1.4末端加“A”(A-Tailing)

(1)預(yù)先從-20℃保存的試劑盒中取出所需試劑，單個樣本配制量參見表2：

表2

(2)末端加“A”反應(yīng)：加入32μL上一步純化回收的DNA后將1.5mL離心管置于Thermomixer中37℃溫浴30分鐘。使用1.8×核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，溶于18μL EB中。

1.5接頭的連接(Adapter Ligation)

(1)預(yù)先從-20℃保存的試劑盒中取出所需試劑，單個樣本配制量參見表3：

表3

(2)接頭的連接反應(yīng)：加入18μL上一步純化回收的DNA后將樣本管置于Thermomixer中20℃溫浴15分鐘。使用1.8×核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，溶于30μL的EB中。

1.6 PCR反應(yīng)

(1)從-20℃保存的試劑盒中取出所需試劑，2mL的PCR管中配制PCR反應(yīng)體系：

表4

(2)設(shè)定PCR程序，PCR反應(yīng)的程序設(shè)定如下：

反應(yīng)結(jié)束及時將樣品取出放入4℃冰箱保存并按要求退出或關(guān)閉儀器。

(3)用0.9×核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，純化后的文庫溶于20μL的ddH2O中。對文庫進(jìn)行Qubit檢測，將文庫送檢安捷倫2100。

1.7乳腺癌目標(biāo)區(qū)域捕獲芯片文庫雜交

(1)本實(shí)驗(yàn)中，用于提供雜交捕獲反應(yīng)的離子環(huán)境的緩沖液、以及用于洗脫物理吸附或非特異性雜交的清洗液、漂洗液均可從商業(yè)途徑獲得。

(2)準(zhǔn)備雜交文庫：將待雜交的DNA文庫在冰上融化，取總質(zhì)量1μg(在后續(xù)操作步驟中將此DNA文庫稱為樣本文庫)。

(3)制備Ann引物Pool：將樣本文庫Index對應(yīng)的標(biāo)簽引物In1(100μM)及公共引物(1000μM)各取1000pmol混合，(在后續(xù)操作步驟中將此混合物稱為Ann引物pool)。

(4)雜交樣本的制備：向1.5mL EP管中加入5μL COT DNA(Human Cot-1DNA，Life technologies，1mg/mL)、1μg樣本文庫、Ann引物pool。用封口膜密封制備好的雜交樣本EP管，將盛有樣本文庫pool/COT DNA/Ann引物pool的EP管置于真空裝置中直到完全干燥。

(5)雜交樣本的溶液：向樣本文庫pool/COT DNA/Ann引物pool的干粉中加入：

7.5μL 2×雜交緩沖液

3μL 雜交組分A

(6)充分混勻后將上述混合物置于預(yù)先準(zhǔn)備好的95℃加熱模塊上變性10分鐘。

(7)將上述混合物轉(zhuǎn)移至含有4.5μL捕獲芯片的0.2mL平蓋PCR管中。充分渦旋震蕩3秒，將雜交樣品混合物置于47℃加熱模塊上16小時。加熱模塊的熱蓋溫度需設(shè)定為57℃，雜交后產(chǎn)物需進(jìn)行后續(xù)洗脫回收操作。

(8)將10×清洗液(Ⅰ，Ⅱ與Ⅲ)、10×漂洗液和2.5×磁珠清洗液配置成1×工作液。

表5

(9)將下列試劑在47℃加熱模塊中預(yù)熱：

400μL 1×漂洗液

100μL 1×清洗液I

1.8制備親和吸附磁珠

(1)將鏈霉親和素磁珠(Dynabeads M-280Streptavidin，以下簡稱磁珠)在室溫下平衡30分鐘后，將磁珠充分渦旋混勻15秒。

(2)向1.5mL離心管中分裝100μL磁珠，將盛有100μL磁珠的離心管置于磁力架上，約5分鐘后小心吸棄上清，加兩倍于磁珠初始體積的1×磁珠清洗液，渦旋混勻10秒。將盛有磁珠的離心管放回磁力架，吸附磁珠。待溶液澄清，吸棄上清。重復(fù)次步驟，共洗滌兩次。

(3)洗滌完畢后吸棄磁珠清洗液，用磁珠初始體積的1×磁珠清洗液渦旋重懸磁珠轉(zhuǎn)入0.2mL的PCR管中。將PCR管置于磁力架上吸附磁珠澄清后吸棄上清。

1.9 DNA與親和吸附磁珠的結(jié)合及漂洗

(1)將雜交的樣本文庫轉(zhuǎn)入盛有親和吸附磁珠的0.2mL PCR管中，渦旋振蕩混勻。

(2)將0.2mL PCR管置于47℃加熱模塊45分鐘，每隔15分鐘渦旋混勻一次，使DNA與磁珠結(jié)合。

(3)45分鐘孵育后，向15μL捕獲的DNA樣本中加入47℃預(yù)熱的1×清洗液I 100μL。渦旋混勻10秒。將0.2mL PCR管中的全部組分轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中。將1.5mL離心管置于磁力架上吸附磁珠，棄上清。

(4)將1.5mL離心管從磁力架上取下，加入200μL預(yù)熱47℃的1×漂洗液。吸打混勻10次(需迅速操作，防止試劑、樣品溫度低于47℃)。混勻后樣本置于47℃加熱模塊上5分鐘。重復(fù)此步驟，用47℃的1×漂洗液共洗滌兩次。將1.5mL的離心管置于磁力架上，吸附磁珠，棄上清。

(5)向上述1.5mL離心管中加入200μL室溫的1×清洗液I，渦旋混勻2分鐘。將離心管置于磁力架上，吸附磁珠，棄上清。向上述1.5mL離心管中加入200μL室溫的1×清洗液Ⅱ，渦旋混勻1分鐘。將離心管置于磁力架上，吸附磁珠，棄上清。向上述1.5mL離心管中加入200μL室溫的1×清洗液Ⅲ，渦旋混勻30秒。將離心管置于磁力架上，吸附磁珠，棄上清。

(6)1.5mL離心管從磁力架上取下，加入45μL PCR水，溶解洗脫磁珠捕獲樣本。

1.10捕獲DNA的PCR擴(kuò)增

(1)按下表制備捕獲后PCR mix，制備好后渦旋震蕩混勻。富集引物F和富集引物R均購自英濰捷基公司。

(2)磁珠吸附DNA PCR的擴(kuò)增程序設(shè)定如下：

(3)雜交捕獲DNA PCR產(chǎn)物的回收純化：用核酸純化磁珠回收純化反應(yīng)體系中的DNA，磁珠使用量為0.9×，純化后的文庫溶于30μL的ddH₂O中。

1.11文庫定量

對文庫進(jìn)行2100 Bio Analyzer(Agilent)/LabChip GX(Caliper)及QPCR檢測，記錄文庫濃度。

1.12文庫上機(jī)測序

構(gòu)建好的文庫用NextSeq 550AR進(jìn)行測序。

1.13數(shù)據(jù)處理及分析

采用本發(fā)明的FFPE樣本拷貝數(shù)變異檢測裝置對1.12文庫上機(jī)測序的結(jié)果進(jìn)行處理分析。

實(shí)施例1的FFPE樣本拷貝數(shù)變異檢測裝置包括下述模塊。

測序數(shù)據(jù)獲取模塊：

用于獲取使用乳腺癌目標(biāo)區(qū)域捕獲芯片對待檢測的乳腺癌FFPE樣本進(jìn)行捕獲測序獲得測序數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)質(zhì)檢模塊：

對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)檢，過濾掉平均質(zhì)量值低的短序列，過濾掉N含量高的短序列，過濾掉與Adapter相關(guān)的短序列，得到過濾的測序數(shù)據(jù)C。

序列比對模塊：

使用經(jīng)過過濾的測序數(shù)據(jù)C，與人參考基因組HG19進(jìn)行短序列比對，獲得比對結(jié)果A。根據(jù)該比對結(jié)果A計算基因組上的每個位點(diǎn)的深度值，得到結(jié)果D。

前期數(shù)據(jù)處理模塊：

將癌癥目標(biāo)區(qū)域劃分為一定長度且有重疊的窗口，去掉窗口內(nèi)的深度極值并計算深度中值，且計算該窗口內(nèi)的參考基因組序列的GC含量，得到結(jié)果X。

歸一化模塊：

結(jié)合結(jié)果X與D，依據(jù)公式Z_i＝trimScale(Z_i,Z_i)計算得到待檢測基因組DNA每個窗口內(nèi)的Z值。

背景庫篩選模塊：

定義

chr是染色體的意思，St表示待檢測樣本，Sn表示背景庫樣本。

根據(jù)待檢基因組DNA與背景庫的Z值，篩選出使得d值最小的背景庫樣本，得到篩選后的背景庫樣本集S₁,S₂,S₃,…,S_n。

使用這n個樣本在m個窗口內(nèi)的Z值構(gòu)建矩陣X_m×n作為背景庫待用。

數(shù)據(jù)波動消除模塊：

對背景庫矩陣X_m×n做奇異值分解，得到m行n列因子矩陣U_m×n，n為因子個數(shù)。取貢獻(xiàn)率最大的幾個因子進(jìn)行LOESS回歸，得到殘差Z_p。

GC校正模塊：

根據(jù)m個窗口內(nèi)的GC含量，對Z_p基于LOESS回歸做GC矯正，得到殘差Z_pg。

輸出模塊：

輸出模塊用于展示CNV檢測結(jié)果的圖。

檢測結(jié)果如圖2所示，圖中的每一個小圓點(diǎn)為一個窗口的Z_pg值。其中，PIK3CA與ERBB2兩個基因均檢出拷貝數(shù)增加。

1.14結(jié)果驗(yàn)證

同一患者原腫瘤新鮮組織提取RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用QPCR方法驗(yàn)證PIK3CA和ERBB2基因的表達(dá)量是否升高，驗(yàn)證結(jié)果與1.13檢測結(jié)果一致。本發(fā)明的檢測裝置能夠成功檢出FFPE樣本的拷貝數(shù)變異。

工業(yè)實(shí)用性

本發(fā)明的FFPE樣本CNV檢測裝置及檢測方法能夠顯著地提高CNV的檢測靈敏度。