0 μ L，6復(fù)孔，置5% C02, 37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。終 止培養(yǎng)前4h每孔加入5mg/mL的MTT20 μ L，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，輕輕吸棄上清 液，每孔加150 μ L的DMS0,振蕩IOmin使紫色結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定570nm波長(zhǎng)處的吸 光度。增殖率計(jì)算：
[0122] 增殖率（％ )=(受試孔OD值一對(duì)照孔OD值）/對(duì)照孔OD值X 100 % (公式 6) 〇
[0123] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0124] 不同濃度藥性菌質(zhì)多糖對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)表1
[0125] 表-1不同濃度藥性菌質(zhì)多糖對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖作用（0D值，；± ^ )
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[0128] 注：與空白組比較，*P〈0. 01。
[0129] MTT法檢測(cè)藥性菌質(zhì)多糖對(duì)淋巴細(xì)胞增殖作用的影響結(jié)果如表1，與空白組比較， ConA和LPS處理的淋巴細(xì)胞增殖作用極其顯著，JZPC、JZPJ、JZP3試驗(yàn)的4個(gè)濃度均能 促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖（P〈〇. 01)，JZPl和JZP2隨濃度增大，對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖率逐漸減小， 在1000 μ g/mL濃度時(shí)，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖起抑制作用（p〈0. 01)，抑制率分別為15.66%、 13. 25%〇
[0130] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明獲得的藥性菌質(zhì)有較好的免疫調(diào)節(jié)作用。
[0131] 五、藥性菌質(zhì)的急性毒性：
[0132] 1、實(shí)驗(yàn)材料：
[0133] 藥性菌質(zhì)粗多糖：由一、（一）（藥性菌質(zhì)活性部位的提取方法）獲得的藥性菌質(zhì) 粗多糖。
[0134] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明小鼠，雌雄各半，體重18_22g，南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提 供。購(gòu)入后正常飲食及飲水適應(yīng)環(huán)境3-5d，飼養(yǎng)環(huán)境室溫20-25Γ，并觀察除去不合格動(dòng) 物。
[0135] 2、實(shí)驗(yàn)方法：
[0136] 根據(jù)Horn法進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，昆明小鼠隨機(jī)分為3組，每組2只，試驗(yàn)采用灌胃劑量 分別為0.1 、1. 0、10.0 g/kgBW。對(duì)各組小鼠采用相應(yīng)劑量都只進(jìn)行一次灌胃，灌胃后24h內(nèi) 密切觀察小鼠出現(xiàn)的癥狀及死亡數(shù)，估計(jì)大致的最小100%致死量（Dm)和最大0致死量 (Dn) 〇
[0137] 若預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)艿玫紻m和Dn，則按寇氏法進(jìn)行LD5。的測(cè)定。將Dm和Dn換算為常用 的對(duì)數(shù)，然后將最高和最低劑量的對(duì)數(shù)之差，等距分成5個(gè)對(duì)數(shù)，設(shè)5個(gè)劑量組，每組10只 動(dòng)物，雌雄各半，依次稱(chēng)重，記錄體重并染號(hào)。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水12h，小鼠灌胃容量每 次0. 2mLl/10g。給藥后連續(xù)觀察lh，然后于2、4、6、8、12、24h分別觀察1次，以后每天上下 午同一時(shí)間觀察1次，連續(xù)觀察14d并做好觀察記錄，并于第7d和第14d同一時(shí)間稱(chēng)量體 重，并記錄體重。觀察記錄指標(biāo)包括小鼠的活動(dòng)情況、體型外觀，精神狀態(tài)，采食，被毛，對(duì) 外反應(yīng)、異常分泌物、大小便顏色及形狀，呼吸等毒性反應(yīng)及死亡情況，若有死亡，就立即解 剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、胃、大小腸、腦等主要臟器質(zhì)地色澤變化情況。發(fā)現(xiàn)有病變的 器官應(yīng)做病理組織學(xué)檢查。按下列公式計(jì)算LD50及標(biāo)準(zhǔn)誤、95 %可信限。
[0138] LogLD50 = XK-d ( Σ ρ-0· 5)(公式 7)，
[0139] LD50 的標(biāo)準(zhǔn)誤（S): CN 105176844 A 說(shuō)明書(shū) 11/12 頁(yè)
[0141] LD50的95%可信限⑴：
[0142] X = log 1GogLDSO ±1.96 X SlogLD5。）（公式 9)
[0143] 若預(yù)實(shí)驗(yàn)無(wú)法測(cè)出Dm，則進(jìn)行最大耐受量試驗(yàn)。
[0144] 動(dòng)物分組：雄雌性小鼠各10只，依次稱(chēng)重，記錄體重，并染號(hào)。
[0145] 試驗(yàn)開(kāi)始前小鼠禁食不禁水16小時(shí)，根據(jù)受試物最大溶解度和最大灌胃容積 (20mL/kgBW)給予小鼠灌胃。所有小鼠24h內(nèi)灌胃次數(shù)不能超過(guò)3次，間隔時(shí)間4-6h。給 藥后2h提供食物，并連續(xù)觀察lh，于2、4、6、8、12、24h分別觀察1次，以后每天上下午同一 時(shí)間至少各1次，連續(xù)觀察14d做好觀察記錄，并于第7d和第14d同一時(shí)間稱(chēng)量體重，并做 好記錄。觀察指標(biāo)包括小鼠的活動(dòng)、體型外觀，精神狀態(tài)，采食，被毛，對(duì)外反應(yīng)、異常分泌 物、大小便顏色及形狀，呼吸等毒性反應(yīng)及死亡情況，若有死亡，立即解剖，肉眼觀察心、肝、 脾、肺、腎、胃、大小腸、腦等主要臟器的外觀變化。連續(xù)觀察14d并記錄動(dòng)物中毒表現(xiàn)及特 點(diǎn)，毒性反應(yīng)出現(xiàn)、毒性反應(yīng)消失時(shí)間及動(dòng)物死亡時(shí)間，觀察期結(jié)束后將每組存活的小鼠處 死并解剖，檢查小鼠心臟、肺部、肝臟、胸腺、腎臟、腦組織、胃部及腸道等器官的色澤、位置 及質(zhì)地等，肉眼觀察各臟器有無(wú)異常，如有肉眼可見(jiàn)的病變，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
[0146] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0147] 樺褐孔菌菌質(zhì)多糖經(jīng)灌胃給予小鼠后觀察，小鼠行為動(dòng)作與對(duì)照組無(wú)差異。給藥 后第1天觀察，小鼠行為活動(dòng)與對(duì)照組沒(méi)有顯著區(qū)別，對(duì)刺激反應(yīng)迅速，眼睛、鼻孔未見(jiàn)分 泌物，但糞便粘度較大，顏色較平時(shí)偏深，可能產(chǎn)生含多糖類(lèi)便。給藥后第2天觀察，小鼠的 行為活動(dòng)等其他觀察項(xiàng)目與對(duì)照組無(wú)異，小鼠飲食正常。給藥第3天觀察，小鼠行為活動(dòng)與 對(duì)照小鼠無(wú)異，眼睛鼻子也未見(jiàn)分泌物，觀察到其糞便顏色和粘度均和對(duì)照組相同。從給藥 后第4天直到第14天，即到實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)束時(shí)，小鼠的各項(xiàng)觀察指標(biāo)均與正常對(duì)照組無(wú)異，小 鼠無(wú)一例死亡。實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)束時(shí)，小鼠脫白處死進(jìn)行大體解剖，與對(duì)照組對(duì)比仔細(xì)觀察各臟 器顏色質(zhì)地等內(nèi)容，均未發(fā)現(xiàn)異常情況。累計(jì)小鼠灌胃劑量，實(shí)驗(yàn)小鼠對(duì)藥性菌質(zhì)多糖最大 耐受劑量大于21g/kg。其體重變化與死亡情況見(jiàn)表2。
[0148] 表2-急性毒性試驗(yàn)小鼠體重變化及死亡情況（&士S )
[0150] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明獲得的藥性菌質(zhì)毒性極小或無(wú)毒性。
[0151] 本發(fā)明將樺褐孔菌接種在中藥材或中藥渣藥性基質(zhì)上進(jìn)行雙向固體發(fā)酵，生產(chǎn)的 藥性菌質(zhì)無(wú)毒性，具有良好的抗氧化作用、降糖作用和免疫調(diào)節(jié)等作用，有效解決了珍稀藥 用真菌-樺褐孔菌的資源短缺問(wèn)題，并為中藥渣的有效再利用開(kāi)辟了新途徑。
[0152] 上面對(duì)本專(zhuān)利的較佳實(shí)施方式作了詳細(xì)說(shuō)明，但是本專(zhuān)利并不限于上述實(shí)施方 式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專(zhuān)利宗旨的前提下 作出各種變化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種樺褐孔菌的中藥材或中藥渣的雙向固體發(fā)酵方法，其特征在于，具體步驟包括： 發(fā)酵基質(zhì)的準(zhǔn)備，即對(duì)藥性基質(zhì)的處理；發(fā)酵菌種樺褐孔菌的處理；將樺褐孔菌接種于藥 性基質(zhì)上；進(jìn)行雙向固體發(fā)酵；收集藥性菌質(zhì)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樺褐孔菌的中藥材或中藥渣的雙向固體發(fā)酵方法，其特征 在于，所述藥性基質(zhì)在處理時(shí)，對(duì)藥性基質(zhì)進(jìn)行粉碎，加入水使其含水量為50-65%，裝瓶并 121C尚壓滅困lh。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樺褐孔菌的中藥材或中藥渣的雙向固體發(fā)酵方法，其特 征在于，所述發(fā)酵菌種的處理方法是將樺褐孔菌進(jìn)行活化后，并于28°C條件下擴(kuò)增培養(yǎng) 14-16d，擴(kuò)增培養(yǎng)的方法是采用液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樺褐孔菌的中藥材或中藥渣的雙向固體發(fā)酵方法，其特征在 于，所述雙向固體發(fā)酵的發(fā)酵條件為溫度范圍26°C-28°C，發(fā)酵天數(shù)為40-60d。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樺褐孔菌的中藥材或中藥渣的雙向固體發(fā)酵方法，其特征在 于，所述藥性基質(zhì)是指中藥材或中藥渣。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樺褐孔菌的中藥材或中藥渣的雙向固體發(fā)酵方法，其特征在 于，所述中藥材或中藥渣為葛根、葛根芩連湯組方藥材、六味地黃丸組方藥材、葛根藥渣、葛 根芩連湯藥渣或六味地黃丸藥渣。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樺褐孔菌的中藥材或中藥渣的雙向固體發(fā)酵方法，其特征在 于，所述藥性菌質(zhì)是樺褐孔菌在含有中藥材或中藥渣的藥性基質(zhì)上經(jīng)固體發(fā)酵而產(chǎn)生的菌 質(zhì)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種樺褐孔菌的中藥材或中藥渣的雙向固體發(fā)酵方法，具體步驟包括：發(fā)酵基質(zhì)的準(zhǔn)備，即對(duì)藥性基質(zhì)的處理；發(fā)酵菌種樺褐孔菌的處理；將樺褐孔菌接種于藥性基質(zhì)上；在一定條件下進(jìn)行雙向固體發(fā)酵；收集藥性菌質(zhì)，所述藥性基質(zhì)在處理時(shí)，對(duì)藥性基質(zhì)進(jìn)行粉碎，加適量水，裝瓶后高壓滅菌，所述發(fā)酵菌種的處理方法是將樺褐孔菌進(jìn)行活化并于28℃下擴(kuò)增培養(yǎng)14-16d，擴(kuò)增培養(yǎng)的方法是采用液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)。本發(fā)明將樺褐孔菌接種在中藥材或中藥渣藥性基質(zhì)上進(jìn)行雙向固體發(fā)酵，生產(chǎn)的藥性菌質(zhì)無(wú)毒性，具有良好的抗氧化作用、降糖作用和免疫調(diào)節(jié)等作用，有效解決了珍稀藥用真菌-樺褐孔菌的資源短缺問(wèn)題，并為中藥渣的有效再利用開(kāi)辟了新途徑。
【IPC分類(lèi)】A61P39/06, A61P3/10, A61P37/02, C12N1/14, A61K36/07
【公開(kāi)號(hào)】CN105176844
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】謝小梅, 梁永紅, 李東文, 蘇明聲, 王平, 謝小琴
【申請(qǐng)人】江西中醫(yī)藥大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年10月27日