一種防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢桿菌及其微生物菌劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域，具體涉及一種防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢桿 菌，以及含有該解淀粉芽孢桿菌的微生物菌劑，還涉及它們?cè)诜乐畏鸦颐共∩系膽?yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 番前灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.)引起的一種重要病害。該 病害主要危害果實(shí)，造成果實(shí)腐爛，也危害葉、莖和花，番茄減產(chǎn)可達(dá)20%~50%，損失嚴(yán) 重；該病發(fā)病后傳播速度非?？欤瑖?yán)重威脅保護(hù)地番茄生產(chǎn)。其病原菌寄主范圍較廣，除侵 染茄科蔬菜外，還可侵染瓜類、甘藍(lán)、菜豆、萵苣、洋蔥、蘋果等作物。
[0003] 目前，對(duì)番茄灰霉病的主要防治方法有：一是化學(xué)防治?；瘜W(xué)防治雖有見效快、效 率高等優(yōu)點(diǎn)，但是因長期使用會(huì)造成環(huán)境污染、危害害蟲的天敵等缺點(diǎn)，因此逐步被淘汰； 其次是生物防治，由于生物防治藥效高、持效期長、不易產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)日益 受到人們的青睞。
[0004] 芽孢桿菌（Bacillius sp)是一種受到廣泛關(guān)注的生防細(xì)菌，以其分布廣、易分 離培養(yǎng)、能產(chǎn)生抗逆性較強(qiáng)的芽孢、貯藏期長和使用方便等特點(diǎn)，成為一種理想的生防微 生物。因芽孢桿菌能產(chǎn)生內(nèi)生芽孢，有極強(qiáng)的抗逆能力，相比其他類型的生防因子，更有 利于菌劑的生產(chǎn)，在劑型加工環(huán)境中存活、定殖與繁殖。因此，篩選對(duì)病原菌具有抑制 作用的芽孢桿菌是防治有關(guān)植物病害的最有效方法之一。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)是用于防治番前灰霉病的芽孢桿菌之一，目前，用于防治番前灰霉 病的解淀粉芽孢桿菌主要有CGMCC No. 4777(專利號(hào)：ZL201210059785.0)、BA-KA3(專 利【申請(qǐng)?zhí)枴?01410618581. 5)、SZ23(專利【申請(qǐng)?zhí)枴?01410683826. 2)、LH-I (專利【申請(qǐng)?zhí)枴?201410735508. 6)和NCPSJ17(專利【申請(qǐng)?zhí)枴?01310112580. 9)等。由于病原菌的多樣性和 同步進(jìn)化特性，因此需要尋找不同的新菌株防治番茄灰霉病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢桿菌菌株，該菌株具有高 效、廣譜殺菌活性優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明第二目的在于提供一種利用上述解淀粉芽孢桿菌生產(chǎn)的微生物菌劑。
[0007] 本發(fā)明第三目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。
[0008] 本發(fā)明第四目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌菌株在防治番茄灰霉病上的用途。
[0009] 本發(fā)明第五目的在于提供上述微生物菌劑在防治番茄灰霉病上的用途。
[0010] 本發(fā)明第六目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌菌株的鑒定方法。
[0011] 本發(fā)明第七目的在于提供上述微生物菌劑的鑒定方法。
[0012] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0013] 一種解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株 HMB27688,己于 2015 年9月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（保藏地址為：北京 市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)），保藏編號(hào)為CGMCC No. 11457。
[0014] 利用上述解淀粉芽孢桿菌HMB27688生產(chǎn)的微生物菌劑，其活性成分為HMB27688 菌體。
[0015] 上述微生物菌劑可以為液體制劑。
[0016] 上述微生物菌劑，其中HMB27688的活菌數(shù)大于18. OX 10scfu/mL。
[0017] 上述微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟：
[0018] (1)菌種活化：將低溫保存的HMB27688菌株在LB平板培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落 在LB斜面培養(yǎng)基上25~35°C培養(yǎng)10~16小時(shí)，得活化的菌株；
[0019] (2)種子液制備：用無菌的接種環(huán)刮取一環(huán)步驟（1)活化的菌株接種到IOOmL LB 液體培養(yǎng)基中，在25~35°C、搖床轉(zhuǎn)速為150~220rpm的條件下培養(yǎng)10~16小時(shí)，得種 子液；
[0020] (3)發(fā)酵培養(yǎng)：按照體積比為1~3%的比例將步驟⑵的種子液接入到玉米粉 黃豆粉培養(yǎng)基中，在溫度為25~35°C、搖床轉(zhuǎn)速為150~220rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)40~ 50h，得發(fā)酵液；
[0021] (4)檢測發(fā)酵液中菌體和芽胞數(shù)量，待發(fā)酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌體總數(shù)的 90%時(shí)停止發(fā)酵培養(yǎng)；所得即為腿827688菌株的液體制劑。
[0022] 所述的LB平板培養(yǎng)基、LB斜面培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基均按照常規(guī)方法制備。
[0023] 上述制備方法步驟（1)中所述的LB平板培養(yǎng)基或LB斜面培養(yǎng)基，其組成成分及 其重量比為：胰蛋白胨8~12g，酵母提取物4~6g，氯化鈉4~6g，瓊脂粉12~18g，水 1000 mL0
[0024] 上述制備方法步驟（2)中所述的LB液體培養(yǎng)基，其組成成分及其重量比為：胰蛋 白胨8~12g，酵母提取物4~6g，氯化鈉4~6g，水1000mL。
[0025] 上述制備方法步驟（3)中所述的玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基，其組成成分及其重量百分 比為：玉米粉 1.0 ~3.0%，黃豆粉 LO ~3.0%，NaCl 0.1 ~1.0%，MnSO4* H2O 0.5 ~ 1.0%，其余為水；pH值為7. 2。
[0026] 所述的玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基的制備方法，按照重量百分比將玉米粉、黃豆粉、NaCl 和MnSO4 · H2O混合，再加水，調(diào)節(jié)pH攪拌均勾即可。
[0027] 上述解淀粉芽孢桿菌HMB27688在防治番茄灰霉病上的應(yīng)用。
[0028] 上述微生物菌劑在防治番茄灰霉病上的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明微生物菌劑的使用方法：將上述所得微生物菌劑用水稀釋至活菌體數(shù)為 107cfu/mL，于番前灰霉病發(fā)病前進(jìn)行葉面噴霧即可。
[0030] HMB27688菌株的篩選分離過程
[0031] HMB27688菌株是河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所從湖北省荊州市的棉田土壤 中分離得到。2013年4月河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所從湖北省荊州市棉田中五點(diǎn)采 集土樣，混勻后稱取Ig放到250mL的滅菌三角瓶中，加入IOOmL無菌水，放到搖床上，170r/ min振蕩30min，靜置2h，取上清液IOmL加入50mL滅菌離心管中，在80°C恒溫水浴30分鐘， 然后取ImL加無菌水9mL，即成IOmLlO 3倍土壤微生物懸液，繼而將土壤懸液稀釋成10 4、 10 5、10 6倍稀釋液，取各濃度微生物懸液200 μ L涂于LB培養(yǎng)基平板上，每個(gè)濃度重復(fù)3次， 在30°C恒溫培養(yǎng)ld-3d，進(jìn)行細(xì)菌的分離和純化。并以番茄灰霉病為靶標(biāo)，通過平板對(duì)峙 法、離體葉片法、盆栽試驗(yàn)法進(jìn)行生防菌的篩選。結(jié)果從中篩選出一個(gè)對(duì)番茄灰霉病具有明 顯防治效果的菌株，定名為HMB27688。
[0032] HMB27688菌株的分類鑒定：
[0033] (1)形態(tài)特征鑒定
[0034] 在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌體為桿狀，培養(yǎng)IOh后產(chǎn)生芽胞，芽胞中生，橢圓形，胞囊不 膨大，抗酸染色陰性，無伴胞晶體，能運(yùn)動(dòng)，鞭毛周生。在營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)初期菌落淡 乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面濕潤；培養(yǎng)后期菌落淡黃色，邊緣 不整齊，表面干燥有褶皺；在營養(yǎng)瓊脂斜面上劃線培養(yǎng)，呈直線形；在液體培養(yǎng)基中靜止培 養(yǎng)，表面形成白色菌膜。這些形態(tài)特征與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠等編著.科學(xué) 出版社.2001年）中描述的芽孢桿菌屬形態(tài)特征基本一致，初步判斷菌株HMB27688屬于芽 孢桿菌屬（Bacillus)。
[0035] (2)利用16S rDNA序列鑒定分類
[0036] 以HMB27688的基因組DNA為模板，以F27和R1492為引物對(duì)16S rDNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所述的引物序列為：
[0037] F27 :5, AGAGTTTGATCATGGCTCAG3, ；（SEQ ID No: 1)，
[0038] R1492 :5' GGCTACCTTGTTACGACTT3' ；（SEQ ID No:2);
[0039] 16S rDNA 的擴(kuò)增反應(yīng)體系為 50yL:10XPCR Buffer(Mg2+)5yL ;dNTP Mixture(2. 5mM)5 μ L ;Taq(5U/μ L)1 μ L，F(xiàn)27(10 μ mol/L) 1 μ L，R1492(10 μ mol/L) 1 μ L ; HMB27688 的基因組 DNA 50ng ;ddH20 補(bǔ)足至 50 yL。PCR 的反應(yīng)條件為 9