5°C 5min ;95°C 30s， 55°C 30s，72°C I. 5min，30個(gè)循環(huán)；72°C lOmin。將所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，送交上 海生工生物工程有限公司測(cè)序，得到HMB27688的16S rDNA序列（見(jiàn)SEQ ID No:3)。將所 得HMB27688的16S rDNA序列在Genbank中進(jìn)行同源性比較，結(jié)果菌株HMB27688與芽孢桿 菌屬的16S rDNA同源性達(dá)到99% ;構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖I)，HMB27688與芽孢桿菌屬聚 合到一起，說(shuō)明HMB27688屬于芽孢桿菌屬（Bacillus)。
[0040] (3)利用gyrB基因序列鑒定分類
[0041] 以HMB27688基因組DNA為模板，利用芽孢桿菌gyrB基因簡(jiǎn)并引物gyrB-F和 gyrB-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中所述的引物的序列為：
[0042] gyrB-F :5' TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT3' ；（SEQ ID No:4)
[0043] gyrB-R :5, TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC3, ；（SEQ ID No:5)
[0044] gyrB 的 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 50yL:10XPCR Buffer(Mg2+)5yL ;dNTP Mixture(2. 5mM)5 μ L ;Taq (5U/μ L)1 μ L ;gyrB_F (10 μ mol/L)1 μ L，gyrB-R(10 μ mol/ L)lyL;HMB27688 基因組 DNA 50ng;ddH20 補(bǔ)足至 50yL。PCR 的反應(yīng)條件為 95°C5min; 95°C 30s，55°C 45s，72°C lmin，30個(gè)循環(huán)；72°C 10min。將擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海生工生物工程 有限公司測(cè)序，得HMB27688菌株的gyrB基因序列（見(jiàn)SEQ ID No:6)。將獲得的HMB27688 菌株的gyrB基因序列在Genbank中進(jìn)行同源性比較，同時(shí)利用MEGA軟件（Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子進(jìn)化遺傳分析）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn) HMB27688與解淀粉芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性最高；構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖2)， HMB27688菌株與解淀粉芽孢桿菌聚合到一起，說(shuō)明HMB27688為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)，并且是一個(gè)新菌株。
[0045] 綜合以上形態(tài)特征、16S rDNA和gyrB基因序列同源性對(duì)比分析的結(jié)果，可知 HMB27688屬于解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)，并且和現(xiàn)有的解淀粉芽孢 桿菌菌株不同，是一個(gè)新菌株。
[0046] 上述解淀粉芽孢桿菌菌株HMB27688的鑒定方法，包括以待測(cè)菌株的基因組DNA為 模板，以F27和R1492為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為SEQ ID No: 3所示 的核苷酸序列，即為HMB27688菌株。
[0047] 上述解淀粉芽孢桿菌菌株HMB27688的鑒定方法，包括以待測(cè)菌株的基因組DNA為 模板，以gyrB-F和gyrB-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為SEQ ID No: 6所 示的核苷酸序列，即為HMB27688菌株
[0048] 上述微生物菌劑的鑒定方法，包括以待測(cè)菌劑中提取的基因組DNA為模板，以F27 和R1492為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為SEQ ID No: 3所示的核苷酸序 列，即為HMB27688微生物菌劑；或以待測(cè)菌劑中提取的基因組DNA為模板，以gyrB-F和 gyrB-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為SEQ ID N〇:6所示的核苷酸序列，即 為HMB27688微生物菌劑。
[0049] 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：（1)本發(fā)明為防治番茄灰霉病提供了一個(gè)高效的 微生物，開(kāi)辟了一個(gè)新的防治途徑；(2)本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌HMB27688對(duì)番茄灰霉病的 藥效高，平均防效在80. 0%以上，且針對(duì)性強(qiáng)；(3)本發(fā)明微生物菌劑對(duì)人、畜安全，屬于環(huán) 境友好型；(4)利用本發(fā)明方法防治番茄灰霉病不易產(chǎn)生抗藥性；（5)本發(fā)明制備方法簡(jiǎn) 單、成本低、使用簡(jiǎn)單。
【附圖說(shuō)明】
[0050] 圖1.為根據(jù)16S rDNA序列獲得的HMB27688菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖。
[0051] 圖2.為根據(jù)gyrB基因序列獲得的HMB27688菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0052] 下面以具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步清楚地解釋本發(fā)明，但是不以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明 的限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中的百分含 量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為重量百分含量。
[0053] 實(shí)施例1HMB27688微生物菌劑的制備
[0054] 按照如下步驟進(jìn)行：
[0055] (1)菌種活化：將保存于_80°C的菌株HMB27688 (解淀粉芽孢桿菌菌株HMB27688 己于2015年9月29日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào) 為CGMCC No. 11457)在LB平板培養(yǎng)基（其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提 取物5g，氯化鈉5g，瓊脂粉15g，水1000 mL)上在30°C進(jìn)行活化，挑取單菌落在LB斜面培 養(yǎng)基（其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨l〇g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，瓊脂粉15g，水 1000 mL)上在30°C下培養(yǎng)12小時(shí)，得活化的菌株。
[0056] (2)種子液的制備：按常規(guī)方法制作LB液體培養(yǎng)基（其組成成分及其重量比為： 胰蛋白胨l〇g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，水1000 mL)，在250mL三角瓶中裝入LB液體培養(yǎng) 基100mL，高壓濕熱滅菌，待溫度降到室溫后，每瓶中接入一接種環(huán)步驟（1)中活化的菌株， 在30°C、搖床轉(zhuǎn)速ISOrpm的條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，得種子液。
[0057] (3)玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基的制備：按照重量百分比將玉米粉1. 5%，黃豆粉2. 0%， NaCl 0. 5%，MnSO4 · H2O 0. 6%加入水中，攪拌混合均勻，即得玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基；分裝于 500mL三角瓶中，每瓶200mL ;在121°C對(duì)玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌30分鐘，再降溫到 30°C備用。
[0058] (4)發(fā)酵培養(yǎng)：向步驟（3)所得每瓶玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基200mL中接種步驟（2) 所得種子液2mL ;在30°C、搖床轉(zhuǎn)速ISOrpm條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)36小時(shí)，以后每隔30分鐘 從三角瓶中取樣進(jìn)行鏡檢，對(duì)視野中的芽胞和總菌體數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算芽胞率（芽胞率 (%)=成熟芽胞數(shù)八成熟芽胞數(shù)+菌體數(shù)）X100);芽胞率達(dá)到90%時(shí)停止發(fā)酵培養(yǎng)；共 發(fā)酵培養(yǎng)48h，得解淀粉芽孢桿菌HMB27688的液體制劑。
[0059] 實(shí)施例2解淀粉芽孢桿菌HMB27688對(duì)番茄灰霉菌的拮抗作用試驗(yàn)
[0060] ( -）試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)：2013年8月上旬在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植 物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。
[0061] (二）試驗(yàn)方法：
[0062] (1)供試番茄灰霉菌來(lái)源：番茄灰霉菌BC-I菌株采自河北省保定市容城縣東牛東 莊村番茄病果，經(jīng)河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離純化，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué) 院植物病理系鑒定為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea)，致病力測(cè)定表現(xiàn)為強(qiáng)致病力。
[0063] (2)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)：
[0064] 首先將番茄灰霉菌BC-I在PDA平板上活化，培養(yǎng)4天后在菌落邊緣區(qū)域，用打孔 器（0=6mm)打孔制成菌片，將番茄灰霉菌菌片轉(zhuǎn)接在另一個(gè)PDA平板中央，再將實(shí)施例 1步驟⑴中活化的解淀粉芽孢桿菌HMB27688點(diǎn)接在距指示菌菌片2. 0厘米處，設(shè)空白對(duì) 照（不點(diǎn)接HMB27688菌株的番茄灰霉菌生長(zhǎng)情況）。25°C恒溫培養(yǎng)，待空白對(duì)照即將長(zhǎng)滿 整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，測(cè)量番茄灰霉菌的對(duì)照生長(zhǎng)量（菌落半徑）和處理生長(zhǎng)量（接種HMB27688 后的抑制生長(zhǎng)半徑），拮抗作用用抑菌率表示。計(jì)算公式為：
[0065] 抑菌率（％) =(對(duì)照生長(zhǎng)量-處理生長(zhǎng)量）/對(duì)照生長(zhǎng)量X 100
[0066] 結(jié)果（見(jiàn)表1)解淀粉芽孢桿菌HMB27688對(duì)番茄灰霉菌的抑制率達(dá)88. 16% ;透 明的抑菌帶寬11. 5毫米；說(shuō)明本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌HMB27688對(duì)番茄灰霉菌抑菌性強(qiáng)，具 有防治番茄灰霉病的生防潛力。
[0067] 表1HMB27688菌株對(duì)番茄灰霉菌的拮抗作用試驗(yàn)結(jié)果
[0069] 實(shí)施例3解淀粉芽孢桿菌HMB27