髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在不同HA涂層(HA涂層原始樣:傳統(tǒng)大氣等離子噴涂制備得到的原始HA涂層樣品；高結(jié)晶度納米HA涂層:涂層在0.2mol/L Na3PO4溶液下180°C水熱24h后的樣品)的表面體外培養(yǎng)后細(xì)胞增殖結(jié)果；
圖6為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在不同HA涂層(HA涂層原始樣:傳統(tǒng)大氣等離子噴涂制備得到的原始HA涂層樣品；高結(jié)晶度HA涂層:涂層在pH = 7的水溶液下180°C水熱24h后的樣品；高結(jié)晶度納米HA涂層:涂層在0.2mol/L Na3PO4溶液下180°C水熱24h后的樣品)的表面體外培養(yǎng)后成骨相關(guān)因子——堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)實驗結(jié)果；
圖7為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在不同HA涂層(HA涂層原始樣:傳統(tǒng)大氣等離子噴涂制備得到的原始HA涂層樣品；高結(jié)晶度HA涂層:涂層在pH = 7的水溶液下180°C水熱24h后的樣品；高結(jié)晶度納米HA涂層:涂層在0.2mol/L Na3PO4溶液下180°C水熱24h后的樣品)的表面體外培養(yǎng)后的其他成骨分化因子分析結(jié)果(實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，qRT-PCR)。
【具體實施方式】
[0021]以下結(jié)合附圖和下述實施方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，附圖及下述實施方式僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0022]本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，若將高結(jié)晶度和表面納米結(jié)構(gòu)設(shè)計相結(jié)合，則既可以解決傳統(tǒng)HA涂層的降解性高、植入后易剝離和脫落的缺陷，又有望發(fā)揮涂層的表面納米化結(jié)構(gòu)以提高植入體的骨整合性能，從而完成本發(fā)明。
[0023]本發(fā)明一方面提供一種高結(jié)晶度、納米結(jié)構(gòu)羥基磷灰石(HA)涂層，所述的涂層為高純度(95%以上)的HA涂層；結(jié)晶度達(dá)85%以上；且說涂層表面結(jié)構(gòu)包括納米結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中，納米結(jié)構(gòu)可為無序或有序的納米結(jié)構(gòu)，優(yōu)選為有序的納米結(jié)構(gòu)。納米結(jié)構(gòu)中，納米晶粒的尺寸可為5?lOOnm。本發(fā)明的HA涂層可以形成于鈦合金基底(例如Ti_6Al_4V)的表面，涂層厚度可為50?120 μ m。
[0024]本發(fā)明的HA涂層具有高純度和高結(jié)晶度，從而避免因傳統(tǒng)涂層的相分解和低結(jié)晶度引起涂層降解、進(jìn)而導(dǎo)致涂層脫落和植入體松動等問題，同時，該涂層具有納米結(jié)構(gòu)，可促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附、增殖和成骨分化，進(jìn)而改善HA涂層植入體的成骨活性和骨整合性倉泛。
[0025]圖1中的曲線B、C、D示出本發(fā)明三個示例的HA涂層的XRD圖，由圖可知，本發(fā)明的HA涂層幾乎為HA純相(純度為95%以上)。圖2中的B、C、D示出本發(fā)明三個示例的HA涂層根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)(ISO 13779-3)及其中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 23101.3)所計算的結(jié)晶度的結(jié)果，由圖可知，本發(fā)明的HA涂層的結(jié)晶度達(dá)85%以上，遠(yuǎn)高于醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)晶度不低于62%的要求。
[0026]圖3中的B、C、D、E示出本發(fā)明四個示例的HA涂層的SEM圖，表明本發(fā)明的HA涂層的表面結(jié)構(gòu)為無序或相對有序的納米結(jié)構(gòu)，在E的示例中，涂層中HA晶粒尺寸為10?20nmo
[0027]圖4示出現(xiàn)有HA涂層和本發(fā)明的HA涂層(HA涂層原始樣:傳統(tǒng)大氣等離子噴涂制備得到的原始HA涂層樣品；高結(jié)晶度HA涂層:涂層在pH = 7的水溶液下180°C水熱24h后的樣品；高結(jié)晶度納米HA涂層:涂層在0.2mol/L Na3PO4溶液下180°C水熱24h后的樣品)在pH = 7.25的Tris-HCl緩沖溶液中浸泡不同時間后測其質(zhì)量損失(A)及其鈣離子(Ca2+)釋放(B)情況，由圖4可知，本發(fā)明的高結(jié)晶度納米HA涂層相較于傳統(tǒng)大氣等離子噴涂制備得到的HA涂層，提高了化學(xué)穩(wěn)定性，從而克服了傳統(tǒng)的涂層高溶解度的風(fēng)險，有望延長植入體的使用壽命。
[0028]圖5示出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在現(xiàn)有HA涂層和本發(fā)明的HA涂層(HA涂層原始樣:傳統(tǒng)大氣等離子噴涂制備得到的原始HA涂層樣品；高結(jié)晶度納米HA涂層:涂層在
0.2mol/L Na3PO4溶液下180°C水熱24h后的樣品)的表面體外培養(yǎng)后細(xì)胞增殖結(jié)果。實驗結(jié)果表明:1天和3天細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果差別不大，第5天時，結(jié)晶度納米結(jié)構(gòu)能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，證實高結(jié)晶度納米結(jié)構(gòu)起到促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用。
[0029]圖6示出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在現(xiàn)有HA涂層和本發(fā)明的HA涂層(HA涂層原始樣:傳統(tǒng)大氣等離子噴涂制備得到的原始HA涂層樣品；高結(jié)晶度HA涂層:涂層在pH = 7的水溶液下180°C水熱24h后的樣品；高結(jié)晶度納米HA涂層:涂層在0.2mol/L Na3PO4溶液下180°C水熱24h后的樣品)的表面體外培養(yǎng)后成骨相關(guān)因子——堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)實驗結(jié)果，表明結(jié)晶度的提聞能促進(jìn)ALP表達(dá)，而聞結(jié)晶度納米結(jié)構(gòu)能進(jìn)一步促進(jìn)ALP表達(dá)，進(jìn)而證實納米結(jié)構(gòu)可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。
[0030]圖7示出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在現(xiàn)有HA涂層和本發(fā)明的HA涂層(HA涂層原始樣:傳統(tǒng)大氣等離子噴涂制備得到的原始HA涂層樣品；高結(jié)晶度HA涂層:涂層在pH = 7的水溶液下180°C水熱24h后的樣品；高結(jié)晶度納米HA涂層:涂層在0.2mol/L Na3PO4溶液下180°C水熱24h后的樣品)的表面體外培養(yǎng)后的其他成骨分化因子分析結(jié)果(實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，qRT-PCR)，結(jié)果表明，在特定時間，結(jié)晶度的提高和納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建可有效促進(jìn)相關(guān)成骨因子，如BSP、BMP-2、COLl、OCN、RUNX2、OPN等的高表達(dá)，表明高結(jié)晶度納米結(jié)構(gòu)能促進(jìn)成骨分化，進(jìn)而促進(jìn)骨整合性能。
[0031]本發(fā)明的HA涂層可以采用大氣等離子噴涂和低溫水熱處理技術(shù)相結(jié)合來制備。具體地，作為示例，可以包括以下步驟:
(a)利用燒結(jié)破碎法，制備適合等離子噴涂的HA顆粒，粒徑為20-100μ m ；
(b)采用大氣等離子噴涂工藝，在下述工藝參數(shù)條件下將(a)所制備的HA顆粒沉積于已清洗和噴砂過的鈦合金基體上。所述的噴涂工藝參數(shù)是電弧等離子體氣體氬氣(Ar)的流量為35-45slpm(slpm指標(biāo)準(zhǔn)升/分鐘)，電弧等離子體氣體氫氣(H2)的流量為7-15slpm，粉末載氣Ar的流量為1.5-3.5slpm，噴涂距離為80_120臟，送粉速率為8_30rpm，噴涂電流為500-700A ；
(c)利用低溫水熱處理技術(shù)，獲得高純度、高結(jié)晶度、納米結(jié)構(gòu)的HA涂層。所述的低溫水熱處理條件是溫度為120-250°C，水熱介質(zhì)為pH = 7-12的水溶液、或者濃度為
0.05-2.0mol/L的磷酸鹽溶液，水熱時間為6_72h。
[0032]步驟(a)中，HA顆粒的粒徑優(yōu)選為40_80 μ m。又，具體地，燒結(jié)破碎法可包括以下步驟:將HA粉體壓成直徑為40mm的片子，在1050°C煅燒，破碎后，過200-400目篩子，選取粒徑為40-80 μ m的顆粒作為等離子噴涂顆粒。此外，本發(fā)明中，制備適合等離子噴涂的HA顆粒的方法不限于燒結(jié)破碎法，只要能夠得到粒徑為20-100 μ m的HA顆粒即可。
[0033]步驟(b)中，優(yōu)選的噴涂工藝參數(shù)為電弧等離子體氣體Ar的流量為40slpm，電弧等離子體氣體H2的流量為8slpm，粉末載氣Ar的流量為2.0slpm,噴涂距離為100mm，送粉速率為22rpm，噴涂電流為550A。
[0034]步驟(c)中，pH = 7-12的水溶液可通過用NaOH溶液、HNO3溶液調(diào)節(jié)pH來制備。所述的磷酸鹽溶液包括但不限于(NH4)3PO4溶液、(NH4)2HPO4溶液、Na3PO4溶液、NaH2PO4溶液。在一個優(yōu)選的示例中，水熱處理的條件為:水熱溫度為150?200°C，水熱介質(zhì)為0.1?
1.0mol/L的Na3PO4溶液，水熱時間為12?36小時。
[0035]所制備的HA涂層不但具有高HA含量和高結(jié)晶度，而且表面結(jié)構(gòu)為納米結(jié)構(gòu)。所述涂層在不同水熱條件下水熱后的XRD圖(圖1)顯示，水熱處理后雜質(zhì)峰基本消失，得到的幾乎為HA純相，尤其在pH = 7水溶液下180°C水熱24h后的樣品為HA純相，沒有雜質(zhì)峰的存在，說明水熱處理可使大氣等離子噴涂時高溫環(huán)境下相變產(chǎn)生的磷酸三鈣、磷酸四鈣、氧化鈣等分解的物相逆轉(zhuǎn)變成HA，實現(xiàn)高純度HA涂層的制備。同時，根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)(ISO13779-3)及其中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 23101.3)計算HA涂層的結(jié)晶度，相應(yīng)的結(jié)晶度計算結(jié)果(圖2)表明:水熱處理后，結(jié)晶度由53%提高到85%以上，遠(yuǎn)高于醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)晶度不低于62%的要求。此外，所述涂層在不同水熱條件下水熱后的SEM圖(圖3)顯示，在不同pH水溶液調(diào)控下，表面長出了微米結(jié)構(gòu)，且有少量納米結(jié)構(gòu)，但不夠有序；而在0.2mol/L Na3PO4溶液下180°C水熱24h后的表面結(jié)構(gòu)為相對有序的納米結(jié)構(gòu)，且涂層中HA晶粒尺寸為5-100nm，優(yōu)選為10_20nm。
[0036]體外抗降解性實驗顯示，將所述涂層在pH = 7.25的Tris-HCl緩沖溶液中浸泡不同時間后測其質(zhì)量損失及其Ca2+釋放情況(圖4(A，B))，表明水熱處理能夠提高其化學(xué)穩(wěn)定性，表面納米化能進(jìn)一步提高其化學(xué)穩(wěn)定性，從而克服了傳統(tǒng)的涂層高溶解度的風(fēng)險，可望延長植入體的使用壽命。此外，體外成骨細(xì)胞增殖實驗(圖5)、ALP表達(dá)實驗(圖6)及其成骨因子分化實驗(圖7)結(jié)果表明，結(jié)晶度的提高及納米結(jié)構(gòu)能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及其成骨因子表達(dá)，進(jìn)而證實納米結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)成骨分化，進(jìn)而促進(jìn)骨整合性能。
[0037]綜上所述，高結(jié)晶度和表面納米結(jié)構(gòu)設(shè)計相結(jié)合的HA涂層，既可以解決傳統(tǒng)HA涂層的降解性高、植入后易剝離和脫落的缺陷，又有望發(fā)揮涂層的表面納米化結(jié)構(gòu)以提高植入體的骨整合性能，在硬組織替代修復(fù)材料領(lǐng)域具有獨(dú)特優(yōu)勢。
[0038]下面進(jìn)一步例舉實施例以詳細(xì)說明本發(fā)明。同樣應(yīng)理解，以下實施例