小鼠抗人gfap單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及以原核表達(dá)的GFAP蛋白免疫小鼠獲得的分泌GFAP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株5C8，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]GFAP(glial fibrillary acidic protein，膠質(zhì)纖維酸性蛋白)是構(gòu)成膠質(zhì)細(xì)胞的重要骨架成分，屬于中間纖維絲蛋白家族的重要成員，是星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿中8?1nm的中間絲，常常出現(xiàn)在細(xì)胞核周和胞漿中。GFAP基因位于17q21，其基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為308kb的GFAP-mRNA，蛋白產(chǎn)物為相對(duì)分子質(zhì)量50kDa的中間絲結(jié)構(gòu)蛋白AFAP蛋白主要組成氨基酸為谷氨酸、丙氨酸和亮氨酸，其氨基末端序列與其它中間絲蛋白非常不同，其特異的氨基末端序列為:丙氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸，因此具有生物化學(xué)特征。
[0003]GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)的胞漿細(xì)胞骨架蛋白。大量研究證實(shí)，GFAP在維持星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的正常與穩(wěn)定，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞突起生長(zhǎng)與延長(zhǎng)等方面起著重要作用。GFAP構(gòu)成的中間絲在維持星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和功能上都有作用，參與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞粘附、維持腦內(nèi)髓鞘形成和神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)以及作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;其含量或結(jié)構(gòu)的改變會(huì)引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和功能的變化，是星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大、增生的生理基礎(chǔ)。GFAP也是檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞變化的敏感指標(biāo)。幾乎所有類型腦損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中的GFAP都有增加，發(fā)生代謝性、變性性疾病時(shí)，GFAP的表達(dá)也發(fā)會(huì)生變化。
[0004]GFAP最早是從多長(zhǎng)期患多發(fā)性硬化病人的白質(zhì)硬化斑塊中分離獲得，作為星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)的胞漿細(xì)胞骨架蛋白，GFAP是最廣泛應(yīng)用于識(shí)別正常與病理情況下星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源組織的標(biāo)志物。GFAP作為膠質(zhì)纖維的特異標(biāo)記物，可用于顱內(nèi)腫瘤中膠質(zhì)起源腫瘤的確定；原發(fā)與轉(zhuǎn)移性顱內(nèi)腫瘤鑒別診斷有困難時(shí)，GFAP陽(yáng)性也具有重要的參考意義。有研究通過(guò)對(duì)毛發(fā)型星形細(xì)胞瘤和神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的免疫組化分析證實(shí)，GFAP與該類型腫瘤的預(yù)后有顯著相關(guān)性。可以認(rèn)為GFAP是膠質(zhì)瘤區(qū)別于其他惡性腫瘤的重要特異性標(biāo)志，對(duì)于科研和臨床都十分重要。
目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)獲得了多種GFAP的單克隆抗體，但一直以來(lái)都需要表達(dá)量更多，親和性更好，稀釋度更高，具有更多優(yōu)良特性的單克隆抗體。獲得活性高的GFAP的單克隆抗體對(duì)于臨床診斷和科學(xué)研究具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種高親和性的、可用于科研或臨床免疫組化檢測(cè)GFAP表達(dá)的小鼠抗人GFAP單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:
(O根據(jù)GFAP的基因序列(匪_001131019.2)的編碼框，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，TrizolReagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴(kuò)增GFAP基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體PET28a- GFAP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并親和純化蛋白作為抗原。
[0007](2)采用經(jīng)典的細(xì)胞融合技術(shù)制備GFAP單克隆抗體。親和層析純化抗體蛋白，SDS-PAGE測(cè)定抗體純度，直接ELISA法測(cè)定純化抗體的滴度。
[0008](3)通過(guò)免疫組織化學(xué)分析GFAP單克隆抗體染色人大腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤石蠟切片。
[0009](4)根據(jù)抗體基因的恒定區(qū)序列合成特異性引物，PCR擴(kuò)增單克隆抗體GFAP重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，回收目的片段，克隆到PGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細(xì)胞后篩選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒后測(cè)序確定了單克隆抗體GFAP的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。
[0010]本發(fā)明提供的以原核表達(dá)的GFAP蛋白為抗原、免疫小鼠獲得的分泌GFAP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，名稱為5C8，分類命名為小鼠抗人GFAP雜交瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞株5C8已于2012年11月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6915。
[0011]本發(fā)明還提供了所述雜交瘤細(xì)胞株5C8，CGMCCN0.6915產(chǎn)生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:9，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO: 10。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
本發(fā)明應(yīng)用重組人的GFAP蛋白為免疫抗原，免疫BalbA^Ht，采用經(jīng)典的細(xì)胞融合技術(shù)，通過(guò)ELISA篩選，獲得一株能穩(wěn)定分泌抗GFAP的雜交瘤細(xì)胞株，命名為5C8，亞型鑒定為IgGl，將雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后收集上清，采用Protein A親和層析法對(duì)GFAP單抗進(jìn)行純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后抗體純度在95%以上;ELISA滴度測(cè)定結(jié)果顯示，單抗的滴度均在1:10000以上。人大腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤石蠟切片經(jīng)抗GFAP抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到胞漿內(nèi)呈均勻著色的棕黃色顆粒，背景清晰，無(wú)非特異性著色。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上來(lái)看，本發(fā)明制備了高效價(jià)，高特異性的GFAP單克隆抗體，用該抗體檢測(cè)證實(shí)，其對(duì)細(xì)胞中的GFAP蛋白具有高識(shí)別能力，可用于科研或臨床免疫組化檢測(cè)GFAP表達(dá)。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1SDS-PAGE分析純化后的GFAP單克隆抗體。
[0014]圖2 ELISA法測(cè)定GFAP單克隆抗體滴度。
[0015]圖3是免疫組織化學(xué)檢測(cè)分析GFAP單克隆抗體染色人大腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤石蠟切片。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常施方法。
[0017]實(shí)施例1:雜交瘤細(xì)胞株5C8及其產(chǎn)生的單克隆抗體的獲得
1、抗原制備
(I)獲得目的基因
在該實(shí)施例中，根據(jù)GFAP的基因序列(ΝΜ_001131019.2 )的編碼框，設(shè)計(jì)I對(duì)特異引物: 引物1:5，-GGATCCATGG AGAGGAGACGCATCACCT-3’ (SEQ ID NO:1)
引物2:5 ’ -AATCTCGAGCTAACCGCGAGCCGGCG-3 ’ ；( SEQ ID NO: 2) Trizol Reagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴(kuò)增GFAP基因。
[0018](2)構(gòu)建重組表達(dá)載體
將步驟(I)獲得的PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入表達(dá)載體PET28a，構(gòu)建重組質(zhì)粒 PET28a-GFAP。
[0019](3)獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
將步驟(2)獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，用含有硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作。以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。
[0020](4)誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白純化
將步驟(2)提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，用含有硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選，挑選單克隆至1ml含有硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37°C，220rpm培養(yǎng)10h，取5ml液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至250ml的大瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD值為0.8，加入0.2mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，16°C誘導(dǎo)過(guò)夜，收集菌液超聲，取上清用N1-NTA瓊脂糖親和層析法純化GFAP蛋白
2、單抗的制備和純化。
[0021](I)、免疫動(dòng)物
一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行三次免疫注射。
[0022]首次免疫。純化的重組蛋白GFAP(用適量生理鹽水稀釋)+完全弗氏佐劑，10yg/只，頸背部皮下多點(diǎn)注射；
二次免疫(間隔兩周)。純化的重組蛋白GFAP(用適量生理鹽水稀釋)+不完全弗氏佐劑，10yg/只，頸背部皮下多點(diǎn)注射；
三次免疫(間隔兩周)。純化的重組蛋白GFAP(用適量生理鹽水稀釋)，不完全弗氏佐劑，10yg/只，頸背部皮下多點(diǎn)注射；
三次免疫后7?10天采血，用建立的ELISA法檢測(cè)效價(jià)，選擇效價(jià)最高者用于細(xì)胞融合； 加強(qiáng)免疫(融合前3天)，用純化的重組蛋白50yg腹腔注射。3天后，取脾臟融合。
[0023]⑵、細(xì)胞融合
采用眼球摘除放血法處死小鼠，無(wú)菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液。將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞SP