2/0與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合(1:5-1:10)，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。采用HAT選擇性培養(yǎng)基，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)和篩選。
[0024]用ELISA方法檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清:以純化的GFAP蛋白(10yg/ml)包被酶標(biāo)板，每孔ΙΟΟμΙ，4°C包板過夜。甩掉包被液，加入200μ1 5%的脫脂奶粉，37 °C封閉Ih后，洗滌3次，加雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)檢測上清ΙΟΟμΙ (陰性對照為PBS ΙΟΟμΙ)，37°C孵育I小時。洗滌3遍后，加酶標(biāo)記二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，370C孵育I小時，去掉酶標(biāo)二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50μ1，室溫靜置5分鐘，加終止液50μ1。用酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的OD值。OD值明顯高于陰性對照2倍以上者定為陽性。最后篩選得到一株分泌性能最佳的抗GFAP雜交瘤細(xì)胞株，命名為5C8，亞型鑒定為IgGl。
[0025]將選出的陽性雜交瘤細(xì)胞株5C8克隆化培養(yǎng)(有限稀釋法)，獲得能產(chǎn)生高效價單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆。將雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存保種。所述的陽性雜交瘤細(xì)胞為抗人GFAP雜交瘤細(xì)胞系5C8，該細(xì)胞系已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6915。
[0026](3)單克隆抗體的大量制備與純化
將步驟(2)獲得的細(xì)胞株5C8接種至Balb/c小鼠腹腔，制備腹水，然后從腹水中提取抗體。單克隆抗體GFAP的純化:采用Protein A親和層析法。首先制備protein A親和柱，用PBS平衡柱子后，取抗GFAP的腹水過柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液(PH)洗脫，收集峰值區(qū)的洗脫液，經(jīng)透析濃縮后備用。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后抗體純度在95%以上(參見圖1)。
[0027](4)直接ELISA法測定純化抗體的滴度
以純化的GFAP蛋白(10yg/ml)包被酶標(biāo)板，每孔ΙΟΟμΙ，4°C包板過夜。甩掉包被液，加入200μ1 5%的脫脂奶粉，37 °C封閉Ih后，洗滌3次，將純化的抗體按1: 200,1:400,1:800,1:1600,1:3200,1:6400,1:12800進(jìn)行稀釋，以每孔ΙΟΟμΙ加入酶標(biāo)板中(陰性對照為PBSIΟΟμΙ)，37 °C孵育I小時。洗滌3遍后，加酶標(biāo)記二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37 °C孵育I小時，去掉酶標(biāo)二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50μ1，室溫靜置5分鐘，加終止液50μ1。用酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的OD值。ELISA滴度測定結(jié)果顯示，單抗的滴度均在1:10000以上(參見圖2)。
[0028]實施例2:單克隆抗體免疫組化應(yīng)用檢測
用GFAP單抗，按常規(guī)法作病理切片，對人大腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色。
[0029]具體方法為:
(I)脫蠟
切片依次置于二甲苯1、I1、III中脫蠟，每次5分鐘，移至無水乙醇1、11中各浸泡4分鐘，移至95%酒精中浸泡4分鐘，移至85%酒精中浸泡4分鐘，再移至70%酒精中浸泡4分鐘，流水沖洗2分鐘。
[0030](2)抗原修復(fù)
將已沖洗干凈組織切片放入高壓鍋內(nèi)，加入約3000ml左右的檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(PH6.0)，高火加熱煮沸后調(diào)至低火保持沸騰噴氣3分鐘，關(guān)掉電磁爐開關(guān)，兩分鐘后將高壓鍋移至冷水中冷卻，待高壓鍋內(nèi)抗原修復(fù)液完全冷卻后，打開高壓鍋將組織切片用流水沖洗干凈移至蒸餾水中浸泡2分鐘。
[0031](3)阻斷
將組織切片置于3ffi202中浸泡10分鐘，以流水和蒸餾水分別沖洗。取出切片，擦干組織周圍的水，用免疫組化筆在組織塊周圍畫一圓圈，注意圈接頭要接好，防止抗體跑出圈外造成假陰性。PBS緩沖液沖洗。
[0032](4)滴加一抗
甩去待測組織切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗為實施例1步驟(3)制備并純化的GFAP單克隆抗體，稀釋度為1: 800。放置在孵育盒內(nèi)4°C冰箱中過夜孵育約12小時。
[0033](5)滴加二抗
將孵育盒從冰箱中取出，恢復(fù)至室溫后取出切片，用PBS洗3次，每次5分鐘。滴加通用型二抗-HRP聚合物。將切片放入孵育濕盒中，蓋上蓋子，連孵育盒一起放入37°C恒溫箱中孵育30分鐘。
[0034](6)顯色、襯染、封片
取出切片，擦掉組織周圍的多余的I3BS,加入DAB顯色液中顯色3?5分鐘，在顯微鏡下控制染色的強(qiáng)度。待強(qiáng)度適中后將切片置自來水中終止顯色，再用流水沖洗5?10分鐘，蘇木素染液復(fù)染I分鐘，0.5%鹽酸酒精分化3秒鐘，流水沖洗5?1分鐘，脫水、透明、封片、鏡檢。
[0035]結(jié)果判定:按照國外學(xué)者對組織中GFAP的判定標(biāo)準(zhǔn)，GFAP蛋白陽性反應(yīng)為出現(xiàn)明顯棕黃色物質(zhì)，定位于胞漿。人大腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織(參見圖3)經(jīng)抗GFAP抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到胞漿內(nèi)呈均勻著色的棕黃色顆粒，背景清晰，無非特異性著色，說明此GFAP小鼠單克隆抗體可以特異性的應(yīng)用于免疫組織化學(xué)實驗。
[0036]實施例3:單克隆抗體可變區(qū)測序根據(jù)抗體基因的恒定區(qū)序列合成以下引物:
zh07 5’-GGGGATATCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3’ (SEQ ID NO:3)zhrll 5’-GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3’ (SEQ ID NO:4)z10I 5’-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’ (SEQ ID NO:5)zlr05 5’-GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3’ (SEQ ID NO:6)Trizol Reagent試劑分別提取5 X 16雜交瘤細(xì)胞5C8的總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用zh07和zhrll為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增單克隆抗體GFAP重鏈可變區(qū)，用zlOl和zlr05為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增單克隆抗體GFAP輕鏈可變區(qū)，PCR反應(yīng)均采用熱啟動，反應(yīng)條件:94°C 5分鐘;94°C 45秒，60°C 45秒，72°C I分10秒，30個循環(huán);72°C 7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收純化目的片段(輕鏈長度391 bp，重鏈長度420 bp)?？寺〉絧GEM-T(Promega)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細(xì)胞后在IPTGIX-gal平板上進(jìn)行篩選，取白色菌斑接種于含有氨韋青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增。篩選陽性克隆，用QIAGEN的質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒并進(jìn)行測序，確定了單克隆抗體GFAP的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。
[0037]單克隆抗體GFAP可變區(qū)的DNA序列和氨基酸序列: 單克隆抗體6?々?重鏈可變區(qū)0嫩序列(5’43’，398&?) (SEQ ID NO:7); 單克隆抗體6?4?的輕鏈可變區(qū)0嫩序列(5’—3’，398&?) (SEQ ID N0:8)；
單克隆抗體GFAP重鏈可變區(qū)的推斷氨基酸序列(132氨基酸)(SEQ ID N0:9)；
單克隆抗體GFAP輕鏈可變區(qū)的推斷氨基酸序列(132氨基酸)(SEQ 10 ID NO: 10)。
【主權(quán)項】
1.一種以原核表達(dá)的GFAP蛋白免疫小鼠獲得的分泌GFAP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株5C8，保藏編號為CGMCC N0.6915。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株5C8產(chǎn)生的重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQIDN0:9，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO: 10的免疫球蛋白。
【專利摘要】一種小鼠抗人GFAP單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。所述的分泌GFAP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株克隆號為5C8，保藏編號為CGMCC？No.？6915。本發(fā)明還提供了所述雜交瘤細(xì)胞株5C8產(chǎn)生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ？ID？NO:9，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ？ID？NO:10。該抗體可用于科研或臨床免疫組化檢測GFAP表達(dá)。CGMCC No. 691520121127
【IPC分類】C12N5/20, C12R1/91, C07K16/18
【公開號】CN105646705
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】何小丹, 劉晨, 郝軍鳳
【申請人】天津三箭生物技術(shù)股份有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月30日