一種固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法，屬于水產(chǎn)品加工與利用領域。
【背景技術】
[0002]蛋白質(zhì)酶解的后的產(chǎn)物小肽不但容易消化、吸收，而且還具有抗高血壓、抗膽固醇、抗血栓形成、改善脂質(zhì)代謝、增強人體體能、幫助恢復疲勞、促進鈣磷和其它微量元素的吸收、促進大腦發(fā)育、提高記憶力、增強巨噬細胞和B細胞活力、增強免疫功能、保護表皮細胞、防止黑色素沉淀、消除體內(nèi)自由基等功效。
[0003]關于水產(chǎn)蛋白活性肽的制備，國內(nèi)進行了大量的研究。目前，水產(chǎn)蛋白活性肽的制備方法主要有自溶酶解、酶解法、液態(tài)發(fā)酵法和固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)酶解相結(jié)合的方法這四種。專利申請200810195646.4“內(nèi)源酶制備生物活性小肽的工藝”公開了一種利用海洋低值魚體內(nèi)的內(nèi)源酶自溶酶解的方法制備水產(chǎn)蛋白生物活性小肽的方法。專利申請201410145196.3“一種制備扇貝裙邊活性肽的方法”公開了一種酶解法制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法。專利申請CN102028091A “一種納豆菌發(fā)酵法制備低分子魚肽的方法”公開了一種液體發(fā)酵法制備魚蛋白肽的方法，專利申請201210539941.3“一種由魚蛋白肽和與大豆肽組成的蛋白肽的生產(chǎn)方法”公開了一種由固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)酶解相結(jié)合制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法。
[0004]現(xiàn)有的水產(chǎn)蛋白活性肽制備技術中存在以下缺陷。首先，現(xiàn)有的水產(chǎn)蛋白活性肽制備技術中都有高溫處理的過程。以上制備技術中都有高溫滅酶這一工序;微生物發(fā)酵的方法原料需要滅菌。以上這些高溫處理，會在一定程度減弱制備的功能肽或水產(chǎn)蛋白本身所含其它功能性成分中的生物學活性;另外高溫處理過程，會增強美拉德，使得酶解液顏色變深，為成品加工過程增加了負擔。其次，外加酶酶解的方法需要外加蛋白酶，增加了成本；自溶酶解由于內(nèi)源酶的不足，導致酶解不徹底。另外，微生物發(fā)酵法雖然不用外加蛋白酶，但是原料需要滅菌導致內(nèi)源酶失活，不能充分地有效利用內(nèi)源酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有的水產(chǎn)蛋白活性肽制備技術存在的問題。本發(fā)明的主要目的是提供一種低溫的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法，以便更好地保留制備的功能肽和水產(chǎn)蛋白本身所含功能性成分的生物學活性。本發(fā)明的另一目的是提供一種發(fā)酵法制備活性肽的方法，使得微生物發(fā)酵與內(nèi)源酶酶解過程能有機結(jié)合在一起。本發(fā)明還有一目的是簡化活性肽的制備工序，降低其生產(chǎn)成本。
[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下:一種固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法，包括如下步驟:
(I)將斜面保藏的能產(chǎn)耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL-3接入到滅菌后冷卻的LB液體培養(yǎng)基中，于55 °C、150r/min培養(yǎng)12h，制備成地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)HL-3種子液備用；
(2)將新鮮的水產(chǎn)蛋白絞碎后備用，將植物蛋白粉碎后過60目篩備用；
(3)將步驟(2)制得的絞碎水產(chǎn)蛋白和粉碎后的植物蛋白按質(zhì)量比為0.5?1.5:1的比例混合，并加營養(yǎng)物和水混勻，獲得最終水分含量控制在40%?80%范圍內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基；
(4)往步驟然(3)制得的發(fā)酵培養(yǎng)基上接入步驟(I)所制備的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)HL_3 種子液，并混勾；
(5)固態(tài)發(fā)酵:將步驟(4)獲得的加入菌的發(fā)酵培養(yǎng)基按照下列方法進行發(fā)酵:發(fā)酵培養(yǎng)基分裝在已消毒的發(fā)酵淺盤中，裝料厚度為4cm?8cm，淺盤中發(fā)酵培養(yǎng)基表面覆蓋已滅菌的濕紗布，再將淺盤置于已滅菌的固體發(fā)酵房內(nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在55°060°C，發(fā)酵時間為38h?48h;
(6)液態(tài)酶解:將步驟(5)得到固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物與水按質(zhì)量比為1:3的比例混合，并攪拌均勻后加入到酶解罐中，控制酶解溫度為55°C，酶解2h;
(7)成品的加工:將步驟(6)得到的液態(tài)酶解產(chǎn)物通過過濾去除沉淀得到酶解液;酶解液通過截留分子量為5000道爾頓的超濾膜的超濾去除大分子蛋白質(zhì)而得到透過液;透過液然后通過截留分子量為200道爾頓的納濾膜的納濾去除氨基酸而得到濃縮液;濃縮液經(jīng)過冷凍干燥而得到活性肽成品。
[0007]所述步驟(I)中所用的能產(chǎn)耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌(Baci I Iuslicheniformis)HL-3已于2016年I月18日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC No:60003，保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所。
[0008]所述步驟(2)中的水產(chǎn)蛋白為羅非魚下腳料、南極磷蝦、蝦頭、扇貝裙邊、鱈魚下腳料、魷魚下腳料、牡蠣、青鱗魚下腳料、青魚下腳料、鰱魚下腳料、草魚下腳料和鰹魚下腳料中的一種。所述步驟(2)中的植物蛋白為豆柏、花生柏、棉籽柏和菜柏中的一種或其中兩種以上的混合物。
[0009]所述步驟(3)中的營養(yǎng)物為玉米粉、食品級氯化鈣、食品級氯化亞鐵和食品級磷酸氫二鉀組成的混合物。所述步驟(3 )中的營養(yǎng)物的加入量以添加的營養(yǎng)物的質(zhì)量占發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計，分別為:玉米粉0.0I %?5%，食品級氯化|丐0.01 %?5%，食品級氯化亞鐵0.01%?5%，食品級磷酸氫二鉀0.01%?5%。
[0010]所述步驟(4)中地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL_3種子液的接種量以接入種子液的質(zhì)量占發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計，為I %?15%。
[0011 ]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點。
[0012](I)整個制備過程沒有高溫處理，更好地保留了制備的功能肽和水產(chǎn)蛋白本身所含其它功能性成分中的生物學活性。本發(fā)明申請采用耐高溫地衣芽孢桿菌發(fā)酵，在高溫條件下可以抑制致病菌和腐敗菌的生長，因此本技術中培養(yǎng)基無需滅菌。另外，本技術采用超濾膜去除酶解液中的蛋白酶，無需高溫滅酶。
[0013](2)簡化了工序，降低了成本。由于本發(fā)明申請沒有高溫滅酶的過程，這不但降低了能耗，而且還會大大降低酶解液的美拉德反應，所以酶解液的顏色比較淺。而后續(xù)的膜分離又有一定的脫色效果，因此本技術中可以無需脫色這個程序，簡化了工序，降低了成本。
[0014](3)內(nèi)源酶酶解與微生物發(fā)酵的完美結(jié)合?，F(xiàn)有的發(fā)酵技術中，原料都需滅菌，這不但增加了能耗，而且又使得水產(chǎn)蛋白的內(nèi)源酶失活。本技術中原料無需滅菌，保留了水產(chǎn)蛋白中內(nèi)源酶的活性。并且，微生物發(fā)酵的溫度與內(nèi)源酶的最適酶解溫度一致，使得內(nèi)源酶酶解與微生物發(fā)酵能完美結(jié)合在一起。正是由于本發(fā)明中充分利用內(nèi)源酶的酶解作用，使得本發(fā)明無需另加蛋白酶。
[0015](4)制備成本不但要低于現(xiàn)有固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解技術，而且發(fā)酵效果也要優(yōu)于現(xiàn)有的固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解技術。與現(xiàn)有的采用發(fā)酵法制備活性肽的技術相比，本發(fā)明申請原料無需滅絕，可降低能耗和成本；由于本發(fā)明申請?zhí)峁┑募夹g方案無需高溫滅絕，保留了水產(chǎn)蛋白內(nèi)源蛋白酶的酶活，這是現(xiàn)有的采用常溫發(fā)酵菌種制備活性肽無法做到的，在水產(chǎn)蛋白內(nèi)源蛋白酶的協(xié)助下，本發(fā)明申請可以不用外加蛋白酶。在高溫下蛋白酶酶的活性更強，因此，本技術采用耐高溫菌種進行發(fā)酵，水產(chǎn)蛋白的水解度要高于現(xiàn)有的常溫菌種發(fā)酵技術。
[0016]本發(fā)明提供了一種固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法。本發(fā)明技術作用條件溫和，更多地保留了制備的功能肽和水產(chǎn)蛋白本身所含其它功能性成分中的生物學活性，并且簡化了制備工序和降低了活性肽的生產(chǎn)成本，有著良好的應用前景。
【具體實施方式】
[0017]為了更好地理解本發(fā)明，下面就水產(chǎn)蛋白的種類、植物蛋白的種類、發(fā)酵參數(shù)和發(fā)酵方式的選擇結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍不限于此。
[0018]實施例1:將斜面保藏的能產(chǎn)耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌(Baci I Iuslicheniformis)HL-3接入到滅菌后冷卻的LB液體培養(yǎng)基中，于55°C、150r/min培養(yǎng)12h，制備成地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL-3種子液備用。將新鮮的南極磷4下絞碎后備用；將豆柏粉碎后過60目篩備用。將100公斤絞碎的南極磷蝦和100公斤粉碎并過60目篩的豆柏混合，并加入5公斤玉米粉、500克食品級氯化鈣、500克食品級氯化亞鐵、650克食品級磷酸氫二鉀和10公斤水一起混