勻，獲得混勻后的發(fā)酵培養(yǎng)基;混勻后的發(fā)酵培養(yǎng)加入10公斤地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL-3種子液，攪拌并混合均勾;接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基分裝在已用75%的酒精表面消毒的發(fā)酵淺盤(pán)中，淺盤(pán)中裝料厚度為8厘米，淺盤(pán)中發(fā)酵培養(yǎng)基表面覆蓋滅菌處理的濕紗布，再將淺盤(pán)置于滅菌的固體發(fā)酵房?jī)?nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度為55°C，發(fā)酵時(shí)間為45h;發(fā)酵結(jié)束后，將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物與水按質(zhì)量比為1:3的比例混合并攪拌均勻，加入到酶解罐中，控制酶解溫度為550C，酶解2h;將上面得到的液態(tài)酶解產(chǎn)物通過(guò)過(guò)濾去除沉淀得到酶解液，酶解液通過(guò)截留分子量為5000道爾頓的超濾膜的超濾去除大分子蛋白質(zhì)而得到透過(guò)液;透過(guò)液然后通過(guò)截留分子量為200道爾頓的納濾膜的納濾去除氨基酸而得到濃縮液;濃縮液經(jīng)過(guò)冷凍干燥而得到活性肽成品。
[0019]實(shí)施例2:將斜面保藏的能產(chǎn)耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌(BaciI Iuslicheniformis)HL-3接入到滅菌后冷卻的LB液體培養(yǎng)基中，于55°C、150r/min培養(yǎng)12h，制備成地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL_3種子液備用。將新鮮的南美白對(duì)4下的4下頭絞碎后備用;將花生柏粉碎后過(guò)60目篩備用。將100公斤絞碎的蝦頭和100公斤粉碎并過(guò)60目篩的花生柏混合，并加入6公斤玉米粉、510克食品級(jí)氯化鈣、550克食品級(jí)氯化亞鐵、580克食品級(jí)磷酸氫二鉀和8公斤水一起混勻，獲得混勻后的發(fā)酵培養(yǎng)基;混勻后的發(fā)酵培養(yǎng)加入9公斤地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL-3種子液，攪拌并混合均勾;接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基分裝在已用75%的酒精表面消毒的發(fā)酵淺盤(pán)中，淺盤(pán)中裝料厚度為4厘米，淺盤(pán)中發(fā)酵培養(yǎng)基表面覆蓋滅菌處理的濕紗布，再將淺盤(pán)置于滅菌的固體發(fā)酵房?jī)?nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度為60°C，發(fā)酵時(shí)間為48h;發(fā)酵結(jié)束后，將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物與水按質(zhì)量比為1:3的比例混合并攪拌均勻，加入到酶解罐中，控制酶解溫度為55°C，酶解2h;將上面得到的液態(tài)酶解產(chǎn)物通過(guò)過(guò)濾去除沉淀得到酶解液，酶解液通過(guò)截留分子量為5000道爾頓的超濾膜的超濾去除大分子蛋白質(zhì)而得到透過(guò)液;透過(guò)液然后通過(guò)截留分子量為200道爾頓的納濾膜的納濾去除氨基酸而得到濃縮液;濃縮液經(jīng)過(guò)冷凍干燥而得到活性肽成品。
[0020]實(shí)施例3:將斜面保藏的能產(chǎn)耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌(Baci I Iuslicheniformis)HL-3接入到滅菌后冷卻的LB液體培養(yǎng)基中，于55°C、150r/min培養(yǎng)12h，制備成地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL_3種子液備用。將新鮮的去殼后的牡■絞碎后備用;將豆柏粉碎后過(guò)60目篩備用。將100公斤絞碎的牡蠣和100公斤粉碎并過(guò)60目篩的豆柏混合，并加入4公斤玉米粉、560克食品級(jí)氯化鈣、550克食品級(jí)氯化亞鐵、650克食品級(jí)磷酸氫二鉀和8公斤水一起混勻，獲得混勻后的發(fā)酵培養(yǎng)基;混勻后的發(fā)酵培養(yǎng)加入9公斤地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL-3種子液，攪拌并混合均勾;接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基分裝在已用75%的酒精表面消毒的發(fā)酵淺盤(pán)中，淺盤(pán)中裝料厚度為6厘米，淺盤(pán)中發(fā)酵培養(yǎng)基表面覆蓋滅菌處理的濕紗布，再將淺盤(pán)置于滅菌的固體發(fā)酵房?jī)?nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度為57°C，發(fā)酵時(shí)間為46h;發(fā)酵結(jié)束后，將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物與水按質(zhì)量比為1:3的比例混合并攪拌均勻，加入到酶解罐中，控制酶解溫度為55°C，酶解2h;將上面得到的液態(tài)酶解產(chǎn)物通過(guò)過(guò)濾去除沉淀得到酶解液，酶解液通過(guò)截留分子量為5000道爾頓的超濾膜的超濾去除大分子蛋白質(zhì)而得到透過(guò)液;透過(guò)液然后通過(guò)截留分子量為200道爾頓的納濾膜的納濾去除氨基酸而得到濃縮液;濃縮液經(jīng)過(guò)冷凍干燥而得到活性肽成品。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.本發(fā)明公開(kāi)了一種固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法，其特征在于:該方法包括如下步驟: (1)將斜面保藏的能產(chǎn)耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌(BaciIIuslicheniformis)HL_3接入到滅菌后冷卻的LB液體培養(yǎng)基中，于55 °C、150r/min培養(yǎng)12h，制備成地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)HL-3種子液備用； (2)將新鮮的水產(chǎn)蛋白絞碎后備用，將植物蛋白粉碎后過(guò)60目篩備用； (3)將步驟(2)制得的絞碎水產(chǎn)蛋白和粉碎后的植物蛋白按質(zhì)量比為0.5?1.5:1的比例混合，并加營(yíng)養(yǎng)物和水混勻，獲得最終水分含量控制在40%?80%范圍內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基； (4)往步驟然(3)制得的發(fā)酵培養(yǎng)基上接入步驟(I)所制備的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)HL_3 種子液，并混勾； (5)固態(tài)發(fā)酵:將步驟(4)獲得的加入菌的發(fā)酵培養(yǎng)基按照下列方法進(jìn)行發(fā)酵:發(fā)酵培養(yǎng)基分裝在已消毒的發(fā)酵淺盤(pán)中，裝料厚度為4cm?8cm，淺盤(pán)中發(fā)酵培養(yǎng)基表面覆蓋已滅菌的濕紗布，再將淺盤(pán)置于已滅菌的固體發(fā)酵房?jī)?nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在55°060°C，發(fā)酵時(shí)間為38h?48h; (6)液態(tài)酶解:將步驟(5)得到固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物與水按質(zhì)量比為1:3的比例混合，并攪拌均勻后加入到酶解罐中，控制酶解溫度為55°C，酶解2h; (7)成品的加工:將步驟(6)得到的液態(tài)酶解產(chǎn)物通過(guò)過(guò)濾去除沉淀得到酶解液;酶解液通過(guò)截留分子量為5000道爾頓的超濾膜的超濾去除大分子蛋白質(zhì)而得到透過(guò)液;透過(guò)液然后通過(guò)截留分子量為200道爾頓的納濾膜的納濾去除氨基酸而得到濃縮液;濃縮液經(jīng)過(guò)冷凍干燥而得到活性肽成品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步驟(I)中所用的地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL_3在廣東省微生物菌種保藏中心的保藏編號(hào)為GDMCC No: 60003。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的水產(chǎn)蛋白為羅非魚(yú)下腳料、南極磷蝦、蝦頭、扇貝裙邊、鱈魚(yú)下腳料、魷魚(yú)下腳料、牡蠣、青鱗魚(yú)下腳料、青魚(yú)下腳料、鰱魚(yú)下腳料、草魚(yú)下腳料和鰹魚(yú)下腳料中的一種。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的植物蛋白為豆柏、花生柏、棉籽柏和菜柏中的一種或其中兩種以上的混合物。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步驟(3)中的營(yíng)養(yǎng)物為玉米粉、食品級(jí)氯化鈣、食品級(jí)氯化亞鐵和食品級(jí)磷酸氫二鉀組成的混合物。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步驟(3)中的營(yíng)養(yǎng)物的加入量以添加的營(yíng)養(yǎng)物的質(zhì)量占發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計(jì)，分別為:玉米粉0.01%?5%，食品級(jí)氯化鈣0.01%?5%，食品級(jí)氯化亞鐵0.01%?5%，食品級(jí)磷酸氫二鉀0.01%?5%。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步驟(4)中地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)HL_3種子液的接種量以接入種子液的質(zhì)量占發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計(jì)，為I %?15% ο
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法，包括以下主要步驟：將新鮮的水產(chǎn)蛋白絞碎后備用，將植物蛋白粉碎后過(guò)60目篩備用；絞碎后的水產(chǎn)蛋白和粉碎的植物飼料蛋白混合，并添加營(yíng)養(yǎng)物和水混勻作為發(fā)酵培養(yǎng)基；往發(fā)酵培養(yǎng)基上接入能產(chǎn)耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌（<i>Bacillus？licheniformis</i>）HL-3；接入菌種的培養(yǎng)基于55℃～60℃進(jìn)行固態(tài)好氧發(fā)酵38h～48h；然后固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物加水于55℃酶解2h；液態(tài)酶解產(chǎn)物先后經(jīng)過(guò)濾、超濾和納濾后得到濃縮液，濃縮液經(jīng)冷凍干燥后得到活性肽成品。本發(fā)明技術(shù)作用條件溫和，更多地保留了制備的功能肽和原料本身所含其它功能性成分的生物學(xué)活性，并且簡(jiǎn)化了制備工序和降低了活性肽的生產(chǎn)成本，有著良好的應(yīng)用前景。GDMCC No：6000320160118
【IPC分類(lèi)】C12P21/00, C07K1/34, C12R1/10, C12P21/06
【公開(kāi)號(hào)】CN105648012
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】洪鵬志, 劉喚明, 周春霞, 楊萍
【申請(qǐng)人】廣東海洋大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年3月9日