甜菊糖苷的制作方法
【專利說明】甜菊糖苷 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及包含甜味劑組合物的產(chǎn)品以及制備這種產(chǎn)品的方法。本發(fā)明還涉及甜 味劑組合物在制備產(chǎn)品中的用途以及含甜菊糖苷的組合物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 消費者對使用人工甜味劑(例如甘素、環(huán)氨酸鈉、阿斯巴甜、安賽蜜和糖精）的需求 已有一段時間較低。然而，對天然來源的無熱量高效甜味劑例如甜菊糖苷的需求不斷增長。 此外，甜的甜菊糖苷具有優(yōu)于許多高效甜味劑的功能特性和感官性狀。
[0004] 甜菊糖苷(Masaya Ohta等人，J.Appl .Glycosci，第57卷，（2010)，第199-209頁）是 一組不同的甜的二萜糖苷，它們具有單一的基礎一甜菊醇二萜且差異在于C13和C19位碳水 化合物殘基的存在。
[0005] 萊鮑迪甙A以及一些其它甜菊糖苷的物理特性和感官性狀已被研究（Caroline HelIfritsch等J.Agric Food Chem,第60卷，（2012)，第6782-6793頁）。已檢驗了它們在碳 酸飲料中的穩(wěn)定性并發(fā)現(xiàn)它們具有熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性(Chang和Cook，1983) Aeb-A的甜 味效能（sweetness potency)為鹿糖的200-400倍。
[0006] 然而，除了其高水平的甜味之外，它們還具有后苦味(post-bitter taste)以及金 屬和酒精后味(aftertaste)的固有特性。由于其它物質(zhì)例如多酚和甜菊植物提取物中存在 的其它風味化合物的污染，甜菊糖苷具有一些不期望的味道特征。因此，關于植物來源的甜 菊糖苷提取物的使用存在限制。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 改善味道品質(zhì)的主要方法之一是發(fā)酵生產(chǎn)甜菊糖苷。生產(chǎn)具有期望的純粹味道特 征和最低含量的伴隨化合物的高度純化的各糖苷的另一種方法是在發(fā)酵生產(chǎn)宿主及其發(fā) 酵中通過經(jīng)設計的生物合成來定制特定的甜菊糖苷。
[0009] 因此，本發(fā)明涉及通過發(fā)酵來微生物生產(chǎn)甜菊糖苷的方法和特定產(chǎn)品規(guī)格 (specif ication)的發(fā)酵生產(chǎn)的甜菊糖苷(例如萊鮑迪戒A(rebA))及其用途。也就是說，本 發(fā)明涉及用于生產(chǎn)高度純化rebA的微生物發(fā)酵方法及其在多種食品和飲料中的用途。
[0010] 公開了發(fā)酵生產(chǎn)二萜糖苷和從微生物發(fā)酵液回收二萜糖苷從而獲得產(chǎn)品規(guī)格的 方法。特別地，描述了從微生物發(fā)酵液回收rebA的方法。從微生物發(fā)酵方法可獲得各甜的糖 苷。
[0011] 甜的甜菊糖苷的混合物還可獲自經(jīng)設計的微生物發(fā)酵方法并可通過下游純化工 藝被進一步處理以移除使用過(spent)的發(fā)酵培養(yǎng)基組分。
[0012] 相較于植物提取的甜菊糖苷，發(fā)酵生產(chǎn)的rebA可容易地以高度純化等級以及具有 較少殘余苦味和后味的形式被生產(chǎn)。
[0013] 因此，本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)高純度rebA的方法。所述方法用于生產(chǎn)具有至少約 95 % rebA(基于干重）的產(chǎn)品規(guī)格的高純度rebA。
[0014] 這種產(chǎn)品規(guī)格的發(fā)酵生產(chǎn)的rebA在多種食品和飲料組合物中用作無熱量的甜味 劑并與其它有熱量和無熱量的甜味劑組合使用。
[0015] 這種發(fā)酵生產(chǎn)的rebA在食用和可咀嚼組合物(例如任何飲料、糕點、烘烤食品、餅 干、口香糖等等）中用作無熱量的甜味劑。
[0016] 因此，本發(fā)明的一個目標是提供有商業(yè)價值的由微生物生產(chǎn)系統(tǒng)生產(chǎn)具有已知產(chǎn) 品規(guī)格的高度純化甜味劑的發(fā)酵生產(chǎn)方法及其在多種食品和飲料中，從而克服已知的植物 提取甜菊糖苷的缺點的用途。
[0017] 特別地，發(fā)酵生產(chǎn)的rebA可被用于增加柑橘或酸味屬性、總香氣作用（total aroma impact)、甜芳香復合物（sweet aromatic complex)、乙基麥芽酸（草莓味）或棕果 (brown fruit)(香味(flavor)/香氣(aroma))。
[0018] 本文描述了通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)甜菊糖苷的發(fā)酵方法。本文還描述了用于回收發(fā) 酵生產(chǎn)的甜菊糖苷以及具有給定產(chǎn)品規(guī)格的高度純化rebA的下游純化和回收方法。
[0019] (特定產(chǎn)品規(guī)格的）發(fā)酵生產(chǎn)的甜菊糖苷可被用在多種食品和飲料中作為甜味劑。 也就是說，本發(fā)明基于適用于多種食品和飲料應用的發(fā)酵生產(chǎn)的甜菊糖苷。
[0020] 因此，本發(fā)明提供發(fā)酵來源的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品是包含甜味劑組合物的食品、飲料、 藥物組合物、煙草、營養(yǎng)品、口部衛(wèi)生組合物或化妝品，其中所述甜味劑組合物包含一種或 更多種發(fā)酵生產(chǎn)的甜菊糖苷。
[0021] 本發(fā)明還提供制備產(chǎn)品的方法，所述產(chǎn)品是包含甜味劑組合物的食品、飲料、藥物 組合物、煙草、營養(yǎng)品、口部衛(wèi)生組合物或化妝品，所述方法包括:制備所述產(chǎn)品和摻入包含 一種或更多種發(fā)酵生產(chǎn)的甜菊糖苷的甜味劑組合物。所述方法還可包括:發(fā)酵本文所述的 微生物和從所述微生物和/或細胞外基質(zhì)回收萊鮑迪甙A。
[0022] 本發(fā)明還提供包含一種或多種發(fā)酵生產(chǎn)的甜菊糖苷的甜味劑組合物在制備包含 甜味劑組合物的食品、飲料、藥物組合物、煙草、營養(yǎng)品、口部衛(wèi)生組合物或化妝品中的用 途。
[0023]本發(fā)明還提供一種組合物，其包含基于干燥固體至少約95%發(fā)酵生產(chǎn)的萊鮑迪甙 A0
【附圖說明】
[0024] 圖1展示了質(zhì)粒pUG7_EcoRV的示意圖。
[0025] 圖2展示了設計ERG20、tHMGl和BTSl過表達盒(A)，并將其整合至酵母基因組(B)的 方法的不意圖。（C)顯不了利用Cre重組酶移除KANMX標記后的最終狀態(tài)。
[0026]圖3展示了ERG9敲除構(gòu)建體的示意圖。所述構(gòu)建體由500bp ERG9的3'部分、98bp TRP1的啟動子、TRP1的開放閱讀框和終止子以及之后的400bp ERG9的下游序列組成。由于 在ERG9的開放閱讀框的終點引入了Xbal位點，因此最后的氨基酸變成了絲氨酸，終止密碼 子變成了精氨酸。新的終止密碼子位于TRPl的啟動子中，這導致延長了 18個氨基酸。
[0027]圖4展示了將UGT2整合至基因組的示意圖。A.轉(zhuǎn)化中使用的不同片段;B.整合后的 狀態(tài);C. Cre重組酶表達后的狀態(tài)。
[0028]圖5展示了將GGPP到RebA的途徑整合至基因組的示意圖。A.轉(zhuǎn)化中使用的不同片 段;B.整合后的狀態(tài)。
[0029] 圖6展示了生物合成甜菊糖苷的可行途徑的示意圖。
[0030] 圖7展示了從發(fā)酵液回收甜菊糖苷的方法。
[0031 ] 圖8顯示了每種應用（酸化水、近水(near water)、汁（juice)和可樂（cola))中發(fā) 酵Reb A與基于植物的Reb A的甜味強度分數(shù)。
[0032]圖9顯示了酸化水中發(fā)酵Reb A相對于基于植物的Reb A的強度分數(shù)。
[0033]圖10顯示了近水中發(fā)酵Reb A相對于基于植物的Reb A的強度分數(shù)。
[0034]圖11顯示了汁中發(fā)酵Reb A相對于基于植物的Reb A的強度分數(shù)。
[0035] 序列表說明
[0036]表1展示了序列說明。本文描述的序列可以引用序列表或數(shù)據(jù)庫訪問號（同樣展示 于表1)來定義。
[0037] 發(fā)明詳述
[0038]由下文中給出的詳細的描述，本發(fā)明的優(yōu)點將變得得更明顯。然而，應該理解的 是:詳細的描述和具體實施例在指出本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的同時僅僅通過示例的方式給 出，因為在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改從該詳細描述中對本領域的技術人員 將變得顯而易見。
[0039] 在本說明書和附屬的權利要求書的各個部分，詞語"包括"、"包含"和"具有"及其 變形應被理解為包含性的。也就是說，在語境允許的情況下，這些詞語意圖傳達的意思是： 可以包括其它沒有明確列舉的元素或整體。
[0040] 本發(fā)明涉及包含甜味劑組合物的產(chǎn)品。所述甜味劑組合物包含一種或更多種甜菊 糖苷，它們中的一種或更多種是發(fā)酵制備的。
[0041] 因此，本發(fā)明提供包含一種或更多種甜菊糖苷的溶液。這種溶液可包含萊鮑迪甙 A0
[0042] 基于干燥固體，這種溶液可包含至少約60重量％、至少約70重量％、至少約80重 量％、至少約90重量％、至少約95重量％、至少約99重量％的萊鮑迪甙A。
[0043]因此，本發(fā)明提供這樣的組合物，基于干燥固體，其可包含至少約60重量％、至少 約70重量％、至少約80重量％、至少約90重量％、至少約95重量％、至少約99重量％的發(fā)酵 生產(chǎn)的萊鮑迪甙A。
[0044] 這種組合物可以是顆?；蚍勰＿@種固體組合物可包含至少約60重量％、至少約 70重量％、至少約80重量％、至少約90重量％、至少約95重量％、至少約99重量％的發(fā)酵生 產(chǎn)的萊鮑迪戒A。
[0045] 這種溶液和組合物可通過能夠產(chǎn)生甜菊糖苷的重組微生物的發(fā)酵來制備。合適的 重組微生物如下文所述。所述重組微生物可包含一種或更多種核苷酸序列，所述核苷酸序 列編碼：
[0046] 具有內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；
[0047] 具有內(nèi)根-貝殼杉烯合酶活性的多肽；
[0048] 具有內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶活性的多肽；
[0049] 具有貝殼杉烯酸13-輕化酶活性的多肽，和
[0050] 一種或多種具有UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)活性的多肽，
[0051] 通過所述核苷酸序列的表達使所述微生物具有至少生產(chǎn)一種甜菊糖苷的能力。
[0052] 為了本發(fā)明的目的，具有內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶(EC5.5.1.13)活性的多肽能夠 催化如下化學反應：
[0053]
[0054] 該酶有一種底物(香葉基香葉基焦磷酸）和一種產(chǎn)物（內(nèi)根-柯巴基焦磷酸）。該酶 參與赤霉素的生物合成。該酶屬于異構(gòu)酶家族，具體是分子內(nèi)的裂解酶類。這種酶類的系統(tǒng) 名稱是內(nèi)根-柯巴基-二磷酸裂解酶(去環(huán)化）。其它的常用名包括內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶、 內(nèi)根-貝殼杉烯合酶A和內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶A。
[0055] 為了本發(fā)明的目的，具有內(nèi)根-貝殼杉烯合酶(EC4.2.3.19)活性的多肽能夠催化 下述化學反應：
[0056] 內(nèi)根-柯巴基二磷酸^內(nèi)根-貝殼杉烯+二磷酸鹽
[0057]因此，該酶有一種底物（內(nèi)根-柯巴基二磷酸)和兩種產(chǎn)物（內(nèi)根-貝殼杉烯和二磷 酸鹽）。
[0058]該酶屬于裂解酶家族，具體是作用于磷酸酯的碳-氧裂解酶。這種酶類的系統(tǒng)名稱 是內(nèi)根-柯巴基-二磷酸二磷酸酯-裂解酶(環(huán)化，形成內(nèi)根-貝殼杉烯）。其它的常用名包括 內(nèi)根-貝殼杉烯合酶B、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶B、內(nèi)根-柯巴基-二磷酸二磷酸酯-裂解酶和 (環(huán)化）。該酶參與二萜類化合物的生物合成。
[0059]具有內(nèi)根-柯巴基二磷酸合酶活性的蛋白質(zhì)還可以有截然不同的內(nèi)根-貝殼杉烯 合酶的活性。內(nèi)根-貝殼杉烯合酶催化的反應是赤霉素生物合成途徑中的下一個步驟。這兩 種類型的酶活性是截然不同的，抑制蛋白質(zhì)的內(nèi)根-貝殼杉烯合酶活性的定點突變導致內(nèi) 根-柯巴基焦磷酸的積累。
[0060] 因此，單個核苷酸序列可編碼具有內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶活性和內(nèi)根-貝殼杉烯 合酶活性的多肽。或者，可以用兩段截然不同的、分開的核苷酸序列編碼這兩種活性。
[0061] 為了本發(fā)明的目的，具有內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶(EC1.14.13.78)活性的多肽能夠 催化內(nèi)根-貝殼杉烯的4-甲基的連續(xù)三次氧化以產(chǎn)生貝殼杉烯酸。這種活性通常需要細胞 色素 P450的存在。
[0062] 為了本發(fā)明的目的，具有貝殼杉烯酸13-羥化酶活性(EC1.14.13)活性的多肽能夠 催化利用NADPH和O2形成甜菊醇(對映 -貝殼杉-16-烯-13-醇-19-羧酸）的反應。這種活性也 可被稱為內(nèi)根-貝殼杉烯13-羥化酶活性。
[0063] 可被發(fā)酵以產(chǎn)生用于本發(fā)明方法中的發(fā)酵液的重組微生物包括一種或多種核苷 酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)活性的多肽，通過所述核苷 酸序列的表達使重組微生物能夠生產(chǎn)甜菊單糖苷、甜菊雙糖苷、甜菊苷或萊鮑迪甙A、萊鮑 迪戒B、萊鮑迪戒C、萊鮑迪戒D、萊鮑迪戒E、萊鮑迪戒F、甜茶苷、杜克戒A或萊鮑迪戒M中的至 少一種。
[0064] 為了本發(fā)明的目的，具有UGT活性的多肽具有糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4)活性，即作為催 化劑能夠催化單糖基團從有活性的的核苷酸糖(又稱"糖基供體"）轉(zhuǎn)移至糖基受體分子(通 常是醇）WGT的糖基供體通常是核苷酸糖尿苷二磷酸葡萄糖(尿嘧啶-二磷酸葡萄糖，UDP-葡萄糖）。
[0065]可以選擇所使用的UGTs以產(chǎn)生期望的二砲糖苷，例如甜菊糖苷。Humphrey等人， Plant Molecular Biology(2006)61:47-62和Mohamed等人，J.Plant Physiology 168 (2011)1136-1141中展示了甜菊糖苷形成的示意圖。此外，圖6展示了甜菊糖苷形成的示意 圖。
[0066] 萊鮑迪甙A的生物合成涉及糖苷配基甜菊醇的葡糖基化。具體而言，萊鮑迪甙A可 通過以下步驟形成:首先葡糖基化甜菊醇的13-OH形成13-0-甜菊單糖苷，然后葡糖基化甜 菊單糖苷的13-0-葡萄糖的C-2 '形成甜菊醇-1，2二糖苷，接著葡糖基化甜菊醇-1，2二糖苷 的C-19羥基形成甜菊糖苷，以及葡糖基化甜菊糖苷的C-13-0-葡萄糖的C-3'形成萊鮑迪甙 A。各個葡糖基化反應發(fā)生的順序可以變化一參見圖6。如該示意圖中所示，一種UGT可以催 化不止一種轉(zhuǎn)換。
[0067] 通過在重組宿主中表達編碼功能UGTs(UGT74Gl、UGT85C2、UGT76GGPUGT2W9S 因，可以實現(xiàn)從甜菊醇到萊鮑迪甙A或萊鮑迪甙D的轉(zhuǎn)換。因此，當表達這四種UGTs的重組微 生物產(chǎn)生甜菊醇或向培養(yǎng)基中補加甜菊醇時，該微生物能夠制造萊鮑迪甙A。通常，這些基 因中的一個或多個是重組基因，它們被轉(zhuǎn)化到天生不具有這些基因的微生物中。所有這些 酶的實例都展示在表1中。重組微生物可包括1^了7461、1^了8502、1^了7661和1^了2的任意組 合。在表1中，序列UGT64G1被表示為序列UGT1，序列UGT74G1被表示為序列UGT3,序列 UGT76G1被表示為序列UGT4，序列UGT2被表示為序列UGT2。
[0068]包含編碼具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重組微生物可以包括一種核苷酸序 列，其中所述核苷酸序列編碼能夠催化向甜菊醇添加 C-13-葡萄糖的多肽。也就是說，重組 微生物可包含能夠催化將甜菊醇轉(zhuǎn)換為甜菊單糖苷的UGT。因此，這種核苷酸序列的表達可 以使重組微生物至少能產(chǎn)生甜菊單糖苷。
[0069] 這種微生物可包括編碼具有UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)UGT85C2所顯示的活性的多肽 的核苷酸序列，通過將所述核苷酸序列轉(zhuǎn)化至微生物中，使細胞能夠?qū)⑻鹁沾嫁D(zhuǎn)換為甜菊 單糖苷。
[0070] UGT85C2的活性是向甜菊醇的13-OH轉(zhuǎn)移一個葡萄糖單元。因此，合適的UGT85C2可 以起尿嘧啶5 二磷酸葡糖基:甜菊醇13-OH轉(zhuǎn)移酶和尿嘧啶5 二磷酸葡糖基:甜菊醇-19-〇-葡糖苷13-OH轉(zhuǎn)移酶的作用。功能UGT85C2多肽還可以催化葡糖基轉(zhuǎn)移酶反應，該反應利 用甜菊糖苷，而非甜菊醇和甜菊醇-19-0-葡糖苷作為底物。這種序列在表1中被表示為序列 UGTl。
[0071 ]包含編碼具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重組微生物還可以包括一種核苷酸 序列，其中所述核苷酸序列編碼能夠催化向甜菊醇或甜菊單糖苷添加 C-13-葡萄糖的多肽。 也就是說，重組微生物可包括能夠催化將甜菊單糖苷轉(zhuǎn)換為甜菊雙糖苷的UGT。因此，這種 微生物可以將甜菊單糖苷轉(zhuǎn)換為甜菊雙糖苷。這種核苷酸序列的表達可以使重組微生物至 少能產(chǎn)生甜菊雙糖苷。
[0072] 合適的重組微生物還可以包含編碼具有UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)UGT74G1所顯示的 活性的多肽的核苷酸序列，通過將所述核苷酸序列轉(zhuǎn)化至微生物中，使細胞能夠?qū)⑻鹁諉?糖苷轉(zhuǎn)換為甜菊雙糖苷。
[0073]合適的重組微生物還可以包括編碼具有UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)UGT2所顯示的活性 的多肽的核苷酸序列，通過將所述核苷酸序列轉(zhuǎn)化至微生物中，使細胞能夠?qū)⑻鹁諉翁擒?轉(zhuǎn)換為甜菊雙糖苷。
[0074]合適的UGT2多肽起著尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-13-0-葡糖苷轉(zhuǎn)移酶(也被 稱為甜菊醇-13-單葡糖苷1，2-轉(zhuǎn)葡糖基酶)的作用，它將葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至受體分子(甜菊 醇-13-0-葡糖苷)的13-0-葡萄糖的C-2 '。通常，合適的UGT2多肽還起著尿嘧啶5二磷酸葡 糖基:甜茶苷轉(zhuǎn)移酶的作用，它將葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至受體分子(甜茶苷)的13-0-葡萄糖的C-2，。
[0075]功能UGT2多肽還可以催化利用甜菊糖苷，而非甜菊醇-13-0-葡糖苷和甜茶苷作為 底物的反應，例如功能UGT2多肽可以利用甜菊苷作為底物，將葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至19-0-葡萄 糖殘基的C-2'以產(chǎn)生萊鮑迪甙E。功能UGT2多肽還可以利用萊鮑迪甙A作為底物，將葡萄糖 部分轉(zhuǎn)移至19-0-葡萄糖殘基的C-2'以產(chǎn)生萊鮑迪甙D。但是功能UGT2多肽通常不能將葡萄 糖部分轉(zhuǎn)移至C-13位有1，3_鍵葡萄糖的甜菊醇化合物，即不能將葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至甜菊醇 1，3-二苷和1，3-甜菊苷。
[0076] 功能UGT2多肽還可以從不同于尿嘧啶二磷酸葡萄糖的其他供體轉(zhuǎn)移糖部分。例 如，功能UGT2多肽可以起尿嘧啶5 二磷酸D-木糖基:甜菊醇-13-0-葡糖苷轉(zhuǎn)移酶的作用， 將木糖部分轉(zhuǎn)移至受體分子(甜菊醇-13-0-葡糖苷）的13-0-葡萄糖的C-2'。又例如，功能 UGT2多肽能夠起尿嘧啶5'-二磷酸L-鼠李糖基:甜菊醇-13-0-葡糖苷轉(zhuǎn)移酶的作用，將鼠李 糖部分轉(zhuǎn)移至受體分子(甜菊醇-13-0-葡糖苷)的13-0-葡萄糖的C-2'。這種序列在表1中被 表不為序列UGT2。
[0077] 可被發(fā)酵以產(chǎn)生用于本發(fā)明方法中的發(fā)酵液的包含編碼具有UGT活性的多肽的核 苷酸序列的重組微生物還可以包括一種核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼能夠催化向 甜菊雙糖苷添加 C-19-葡萄糖的多肽。也就是說，合適的重組微生物可包括能夠催化將甜菊 雙糖苷轉(zhuǎn)換為甜菊苷的UGT。因此，這種微生物可以將甜菊雙糖苷轉(zhuǎn)換為甜菊苷。這種核苷 酸序列的表達可以使重組微生物至少能產(chǎn)生甜菊苷。
[0078] 合適的重組微生物還可以包括編碼具有UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)UGT74G1所顯示的 活性的多肽的核苷酸序列，通過將所述核苷酸序列轉(zhuǎn)化至微生物中，使細胞能夠?qū)⑻鹁针p 糖苷轉(zhuǎn)換為甜菊苷。
[0079]合適的UGT74G1多肽可以將葡萄糖單元分別轉(zhuǎn)移至甜菊醇的13-OH或19-C00H。合 適的UGT74G1多肽可以起尿嘧啶5 ' -二磷酸葡糖基:甜菊醇19-C00H轉(zhuǎn)移酶和尿嘧啶5 ' -二磷 酸葡糖基:甜菊醇13-0-葡糖苷19-C00H轉(zhuǎn)移酶的作用。功能UGT74G1多肽還可以催化糖基轉(zhuǎn) 移酶反應，該反應利用甜菊糖苷，而非甜菊醇和甜菊醇-13-0-葡糖苷作為底物，或者該反應 從不同于尿嘧啶二磷酸葡萄糖的供體轉(zhuǎn)移糖部分。這種序列在表3中被表示為序列UGT1。 [0080]包含編碼具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重組微生物可包括一種核苷酸序 列，其中所述核苷酸序列編碼能夠催化甜菊苷的C-13位葡萄糖的C-3'的糖基化的多肽。也 就是說，重組微生物可包括能夠催化將甜菊苷轉(zhuǎn)換為萊鮑迪甙A的UGT。因此，這種微生物可 以將甜菊苷轉(zhuǎn)換為萊鮑迪甙A。這種核苷酸序列的表達可以使重組微生物至少能產(chǎn)生萊鮑 迪甙A。
[0081 ]合適的重組微生物還可以包括編碼具有UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)UGT76G1所顯示的 活性的多肽的核苷酸序列，通過將所述核苷酸序列轉(zhuǎn)化至微生物中，使細胞能夠?qū)⑻鹁哲?轉(zhuǎn)換為萊鮑迪戒A。
[0082]合適的UGT76G1將葡萄糖部分添加到受體分子(甜菊醇1，2_糖苷）的C-13-0-葡萄 糖的C-3'。因此，UGT76G1起著例如，尿嘧啶5 '-二磷酸葡糖基：甜菊醇13-0-1，2葡糖苷C-3' 葡糖基轉(zhuǎn)移酶和尿嘧啶5 二磷酸葡糖基:甜菊醇19-0-葡萄糖，13-0-1，2二苷C-3 '葡糖基 轉(zhuǎn)移酶的作用。功能UGT76G1多肽還可以催化葡糖基轉(zhuǎn)移酶反應，該反應利用含糖（除葡萄 糖外）的甜菊糖苷(例如甜菊鼠李糖苷和甜菊木糖苷)作為底物。這種序列在表1中被表示為 序列UGT4。
[0083]重組微生物可以包括編碼具有上述四種UGT活性中的一種或多種的多肽的核苷酸 序列。優(yōu)選地，重組微生物可以包括編碼具有全部上述四種UGT活性的多肽的核苷酸序列。 給出的核酸可以編碼具有一種或多種上述活性的多肽。例如，編碼具有2種、3種或4種上述 活性的多肽的核酸。優(yōu)選地，重組微生物包括UGTl活性、UGT2活性和UGT3活性。更優(yōu)選地，這 種重組微生物還包括UGT4活性。
[0084]包含編碼具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重組微生物可包含核苷酸序列，所 述核苷酸序列編碼能夠催化甜菊苷或萊鮑迪甙A的葡糖基化。也就是說，重組微生物可包括 能夠催化將甜菊苷或萊鮑迪甙A轉(zhuǎn)換為萊鮑迪甙D的UGT。因此，這種微生物可以將甜菊苷或 萊鮑迪甙A轉(zhuǎn)換為萊鮑迪甙D。這種核苷酸序列的表達可以使重組微生物至少能產(chǎn)生萊鮑迪 甙D。我們已經(jīng)證明：表達UGT85C2、UGT2、UGT74G1和UGT76G1多肽組合物的微生