95、97、146、164、165、166、167或185中展示的序列。優(yōu)選的KAH是由在SEQ ID NO:33中展示的核酸編碼的多肽。
[0170] 合適的重組微生物可以表達(dá)由SEQ ID N0:85和SEQ ID NO: 33或上述二者之一的 變體(如本文所述)編碼的多肽的組合物。一種優(yōu)選的重組微生物可以表達(dá)表8中展示的序 列組合(與任意UGT2組合，但尤其是與由SEQ ID從):87編碼的1?了2組合）。
[0171] 編碼UGT的核苷酸序列可以包括，例如在SEQ ID N0:35、37、39、41、43、45、47、49、 51、71、73、75、168、169、170、171、172、173、174、175、176、147、148、149、87、181、99、100、 101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、 139、140、189、190、191 或 192 中展示的序列。
[0172] 編碼羥甲基戊二酸-輔酶A還原酶的核苷酸序列可以包括，例如在SEQ ID N0:79中 展示的序列。
[0173] 編碼法尼基-焦磷酸合酶的核苷酸序列可以包括，例如在SEQ ID N0:81中展示的 序列。
[0174] 編碼香葉基香葉基二磷酸合酶的核苷酸序列可以包括，例如在SEQ ID NO:83中展 示的序列。
[0175] 編碼NADPH-細(xì)胞色素 p450還原酶的核苷酸序列可以包括，例如在SEQ ID NO: 53、 55、57或77中展示的序列。
[0176] 對于UGT序列，選自以下每組中至少一種序列的組合可能是優(yōu)選的，其中所述組 是：（i)SEQ ID N0:35、37、168、169、71、147Sl89;(ii)SEQIDN0:87、99、101、103、105、 107、109、lll、18lSl92;(iii)SEQIDN0:39、41、43、45、47、170、171、172、173、174、73、148 或190;和（iv)SEQ ID勵(lì):49、51、175、176、75、149或191。通?？梢允褂弥辽僖环N組（〇的 UGT。如果使用了至少一種組（iii)的UGT，那么通常也使用至少一種組（i)的UGT。如果使用 了至少一種組（iv)的UGT，那么通常使用至少一種組（i)的UGT和至少一種組(iii)的UGT。通 常使用至少一種組（ii)的UGT。
[0177] 本發(fā)明可使用與上述序列的序列同一性至少約10 %、約15 %、約20 %，優(yōu)選地至少 約25 %、約30 %、約40 %、約50 %、約55 %、約60 %、約65 %、約70 %、約75 %、約80 %、約85 %、 約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的序列。
[0178] 為了增加被引入的酶在重組微生物中以活性形式表達(dá)的可能性，可修改相應(yīng)的編 碼核苷酸序列以將其密碼子使用(codon usage)優(yōu)化為所選真核宿主細(xì)胞的密碼子使用。 編碼酶的核苷酸序列相對于所選宿主細(xì)胞的密碼子使用的適應(yīng)性可被表示為密碼子適應(yīng) 指數(shù)(CAI)。"密碼子適應(yīng)指數(shù)"在本文中被定義為:一個(gè)基因的密碼子使用相對高表達(dá)基因 的密碼子使用的相對適應(yīng)性的度量值。每種密碼子的相對適應(yīng)度(w)指的是對于同一個(gè)氨 基酸，該密碼子相對于最高豐度密碼子的使用率。CAI被定義為這些相對適應(yīng)性數(shù)值的幾何 平均數(shù)。非同義密碼子和終止密碼子(取決于遺傳密碼)被排除在外。CAI值在0-1之間，較高 的值表示最高豐度的密碼子的比例較高（參見Sharp和Li，1987 ,Nucleic Acids Research 15:1281-1295;亦可參見：Jansen等人，2003 ,Nucleic Acids Res .31 (8) :2242-51 )。優(yōu)選 地，經(jīng)修改的核苷酸序列的CAI值至少為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7。
[0179]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，用核苷酸序列遺傳修飾重組微生物，其中使用密碼對 優(yōu)化技術(shù)(如在PCT/EP2007/05594中所公開的）修改所述核苷酸序列的密碼子使用為真核 細(xì)胞的密碼子使用。密碼對優(yōu)化技術(shù)是用于在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽的方法，其中就編碼多 肽的核苷酸序列的密碼子使用(尤其是被使用的密碼對)對核苷酸序列進(jìn)行修飾，以改善編 碼多肽的核苷酸序列的表達(dá)和/或提高多肽的產(chǎn)量。密碼對被定義為:編碼序列中的一組2 個(gè)連續(xù)的三聯(lián)體(密碼子）。
[0180 ]可利用公知的方法(例如易錯(cuò)PCR或定向進(jìn)化)進(jìn)一步提高重組微生物體內(nèi)酶的活 性。W003010183和W003010311中描述了定向進(jìn)化的優(yōu)選方法。
[0181] 合適的重組微生物可以是微生物來源的任何合適的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主 細(xì)胞是酵母或絲狀真菌。更優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞屬于下述屬之一：Saccharomyces、 AspergilIus、Penici Ilium、Pichia、Kluyveromyces、Yarrowia、Candida、Hansenula、 Humicola、Torulaspora、Trichosporon、Brettanomyces、PachysoIen或Yamadazyma或 Zygosaccharomyces 〇
[0182] 更優(yōu)選的微生物屬于下述物種：Aspergillus niger、Penicillium chrysogenum、 Pichia stipidis、Kluyveromyces marxianus、K.lactis、K.thermotolerans、Yarrowia IipoIytica、Candida sonorensis、C·glabrata、Hansenula poIymorpha、Torulaspora delbrueckii、Brettanomyces bruxellensis、Zygosaccharomyces bailii、Saccharomyces uvarum、Saccharomyces bay anus或Saccharomyces cerevisiae。優(yōu)選的真核細(xì)胞是 Saccharomyces cerevisiae。
[0183] 可修飾所述的重組酵母細(xì)胞以使ERG9基因被下調(diào)和/或ERG5/ERG6基因被刪除。在 其它微生物中，可用相同的方法修飾相應(yīng)的基因。
[0184] 可以轉(zhuǎn)化這種微生物，通過將核苷酸序列轉(zhuǎn)化至所述微生物使細(xì)胞能夠產(chǎn)生二萜 或二萜糖苷。
[0185] 一種優(yōu)選的合適重組微生物是酵母，例如Saccharomyces cerevisiae或Yarrowia Iipo Iyti ca細(xì)胞。重組微生物（例如重組的Saccharomyces cere vis iae細(xì)胞或Yarrowia Iipolytica細(xì)胞)可包括以下每組中的一種或多種核苷酸序列：
[0186] (i)SEQ ID NO:1、3、5、7、17、19、59、61、141、142、152、153、154、159、160、182或 184〇
[0187] (ii)SEQ ID N0:9、ll、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、 183或184。
[0188] (iii)SEQ ID 恥：21、23、25、6785、145、161、162、163、180或186。
[0189] (iv)SEQ ID 恥：27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185。
[0190] 這種微生物通常還包括一種或多種如SEQ ID NO: 53、55、57或77中所示的核苷酸 序列。
[0191] 這種微生物還可以包括一種或多種如SEQ ID N0:35、37、39、41、43、45、47、49、51、 71、73、75、168、169、170、171、172、173、174、175、176、147、148、149、87、181、99、100、101、 102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、 140、189、190、191或192中所示的核苷酸序列。對于這些序列，來自以下每組中至少一種序 列的組合可能是優(yōu)選的，其中所述組是：（i)SEQ ID N0:35、37、168、169、71、147Sl89;(ii) SEQ ID N0:87、99、101、103、105、107、109、lll、18lSl92;(iii)SEQIDN0:39、41、43、45、 47、170、171、172、173、174、73、148Sl90jP(iv)SEQIDN0:49、51、175、176、75、149Sl91。 通?？梢允褂弥辽僖环N組（i)的UGT。如果使用了至少一種組（iii)的UGT，那么通常也使用 至少一種組（i)的UGT。如果使用了至少一種組（iv)的UGT，那么通常使用至少一種組（i)的 UGT和至少一種組（i i i)的UGT。通常使用至少一種組（i i)的UGT。
[0192] 這種微生物還可以包括下述核苷酸序列：SEQ ID N0:79、81和83。
[0193] 對于上述每種序列(或本文提及的任何序列），可以使用與所述序列的序列同一性 至少約15%，優(yōu)選地至少約20 %、25 %、約30 %、約40 %、約50%、約55%、約60 %、約65 %、約 70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的變體。
[0194] 可將編碼內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶、內(nèi)根-貝殼杉烯合酶、內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶、 貝殼杉烯酸13-羥化酶、UGTs、羥甲基戊二酸-輔酶A還原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香葉基香 葉基二磷酸合酶、NADPH-細(xì)胞色素 p450還原酶的核苷酸序列連接至一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體 以促進(jìn)微生物的轉(zhuǎn)化。
[0195] 核酸構(gòu)建體可以是質(zhì)粒，所述質(zhì)粒帶有編碼上述二萜(例如甜菊醇/甜菊糖苷)途 徑中的酶的基因；或者核酸構(gòu)建體可包括兩個(gè)或三個(gè)質(zhì)粒，其中每個(gè)質(zhì)粒分別帶有3個(gè)或2 個(gè)基因，這些基因以任意恰當(dāng)?shù)姆绞椒植疾⒕幋a二萜途徑中的酶。
[0196] 可以使用任何合適的質(zhì)粒，例如低拷貝質(zhì)粒或高拷貝質(zhì)粒。
[0197] 選自內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶、內(nèi)根-貝殼杉烯合酶、內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶和貝殼 杉烯酸13-羥化酶、UGTs、羥甲基戊二酸-輔酶A還原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香葉基香葉基 二磷酸合酶和NADPH-細(xì)胞色素 p450還原酶的酶可以源于宿主微生物，這樣就可以不需要用 一種或多種編碼這些酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化而使宿主細(xì)胞產(chǎn)生二萜或二萜糖苷酶?？梢酝ㄟ^ 經(jīng)典的菌株改良方法，進(jìn)一步提高利用宿主微生物生產(chǎn)二萜/二萜糖苷酶的產(chǎn)量。
[0198] 核酸構(gòu)建體可以維持附加體狀態(tài)，因此其包括自主復(fù)制的序列，例如常染色體復(fù) 制序列。如果宿主細(xì)胞是真菌來源，那么合適的游離核酸構(gòu)建體可以，例如基于酵母2μ或 pKDl質(zhì)粒（Gleer等人，1991 ,Biotechnology 9:968-975)或者AMA質(zhì)粒（Fierro等人，1995， Curr Genet·29:482-489)〇
[0199] 或者，可以將每種核酸構(gòu)建體以單拷貝或多拷貝整合至宿主細(xì)胞的基因組。可以 通過非同源重組將核酸構(gòu)建體隨機(jī)整合至宿主細(xì)胞的基因組，但優(yōu)選地通過本領(lǐng)域公知的 同源重組（參見例如1090/144234?-4-04810084?-4-0635574和1^ 6,265，186)實(shí)現(xiàn)。
[0200] 任選地，核酸構(gòu)建體中可存在選擇標(biāo)記。本文中使用的術(shù)語"標(biāo)記"涉及編碼允許 選擇或篩選含有此標(biāo)記的微生物的性狀或表型的基因。標(biāo)記基因可以是抗生素抗性基因， 能夠通過使用恰當(dāng)?shù)目股貜奈幢晦D(zhuǎn)化的細(xì)胞中選出被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。或者還可以使用非抗 生素抗性標(biāo)記，例如營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記(1]1^3、了1^1、1^1]2)，被這種核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化過的宿主 細(xì)胞可以不含有標(biāo)記基因。EP-A-0635574中公開了構(gòu)建不含重組標(biāo)記基因的微生物宿主細(xì) 胞的方法，該方法基于雙向標(biāo)記的使用?；蛘?，可以使可篩選的標(biāo)記(例如綠色熒光蛋白、半 乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸酶)成為核酸構(gòu)建體的一部分以篩選被轉(zhuǎn)化的細(xì) 胞。W00540186中描述了引入異源多聚核苷酸的優(yōu)選的無標(biāo)記方法。
[0201] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼內(nèi)根-柯巴基焦磷酸合酶、內(nèi)根-貝殼杉烯合酶、內(nèi) 根-貝殼杉烯氧化酶和貝殼杉烯酸13-羥化酶、UGTs、羥甲基戊二酸-輔酶A還原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香葉基香葉基二磷酸合酶和NADPH-細(xì)胞色素 p450還原酶的核苷酸序列各自與 啟動(dòng)子操作性連接，所述啟動(dòng)子能夠使重組微生物中相應(yīng)核苷酸序列充分表達(dá)，從而使細(xì) 胞能夠產(chǎn)生二萜或二萜糖苷。
[0202] 本文中使用的術(shù)語"操作性連接"指的是多聚核苷酸元件(或編碼序列，或核酸序 列）以功能關(guān)系連接。當(dāng)一種核酸序列與另一種核酸序列存在功能關(guān)系時(shí)，則該核酸序列被 與另一種核酸序列"操作性連接"。例如，如果一個(gè)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那 么它與編碼序列操作性連接。
[0203] 本文中使用的術(shù)語"啟動(dòng)子"涉及控制一個(gè)或多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的核酸片段，其位于基 因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游(相對于轉(zhuǎn)錄方向），在結(jié)構(gòu)上可以根據(jù)依賴DNA的RNA聚合酶結(jié)合位 點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和任何其它的DNA序列（包括但不局限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、阻遏蛋白和 激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的直接或間接地從啟動(dòng)子調(diào)控轉(zhuǎn)錄量的任何 其它核苷酸序列）的存在來鑒定。"組成型"啟動(dòng)子指的是在大部分環(huán)境和發(fā)育條件下活躍 的啟動(dòng)子。"誘導(dǎo)型"啟動(dòng)子指的是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)控下活躍的啟動(dòng)子。
[0204] 能夠被用來表達(dá)編碼上文所定義的酶的核苷酸序列的啟動(dòng)子可以不源于編碼要 表達(dá)的酶的核苷酸序列，即啟動(dòng)子和與其操作性連接的核苷酸序列（編碼序列）是異源的。 優(yōu)選地，啟動(dòng)子是同源的，即相對于宿主細(xì)胞是內(nèi)源的。
[0205] 用于重組微生物中的合適的啟動(dòng)子可以是GAL7、GAL10或GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、 卩61^、？!105、64?0!^0(：1、了1^1、1]1^3、1^1]24腸、了？1和4(^1。其它合適的啟動(dòng)子包括130(：、 GPD1、PGK1、TEF0PTDH。
[0206] 可以使用任何在細(xì)胞中有功能的終止子。優(yōu)選的終止子是從宿主細(xì)胞的天然基因 中獲得的。合適的終止子序列是本領(lǐng)域公知的。優(yōu)選地，在宿主細(xì)胞中，這種終止子與阻止 無義介導(dǎo)的mRNA降解的突變體結(jié)合(參見例如：Shir ley等人，2002 ,Genetics 161:1465-1482)〇
[0207] 使用的核苷酸序列可以包括將其錨定至微生物的期望隔室的序列。例如，在一種 優(yōu)選的重組微生物中，除內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶、貝殼杉烯酸13-羥化酶和NADPH-細(xì)胞色素 P450還原酶的編碼序列外的所有核苷酸序列都可被錨定至細(xì)胞溶質(zhì)?？梢栽诮湍讣?xì)胞中使 用這種方法。
[0208] 當(dāng)使用術(shù)語"同源"表示給出的（重組)核酸或多肽分子與給出的宿主生物體或宿 主細(xì)胞之間的關(guān)系時(shí)，可以理解為：本質(zhì)上，核酸或多肽分子由一種宿主細(xì)胞或相同物種 (優(yōu)選的是相同變體或菌株)的生物體產(chǎn)生。
[0209]當(dāng)使用術(shù)語"異源"表示核酸(DNA或RNA)或蛋白質(zhì)時(shí)，其中所涉及的核酸或蛋白質(zhì) 在自然條件下并不作為其存在的生物體、細(xì)胞、基因組或者DNA或RNA序列的一部分出現(xiàn)，或 者是與在自然界發(fā)現(xiàn)的不同的細(xì)胞、位置、基因組或者DNA或RNA序列中發(fā)現(xiàn)的核酸或蛋白 質(zhì)。異源的核酸或蛋白質(zhì)相對于其被引入的細(xì)胞不是內(nèi)源的，但它是從另外一種細(xì)胞或者 合成或重組生產(chǎn)獲得的。
[0210]合適的重組微生物通常包括異源的核苷酸序列?；蛘咧亟M微生物可包括被修飾 (如本文所述)的完全同源的序列，以便所述微生物比同種但未被修飾的微生物產(chǎn)生更大量 的二萜和/或二萜糖苷。
[0211] 可過表達(dá)一種或多種本文所述的二萜途徑中的酶以利用細(xì)胞產(chǎn)生充足的二萜。
[0212] 本領(lǐng)域存在多種用以在宿主細(xì)胞中過表達(dá)酶的有效方法。特別地，可以通過增加 宿主細(xì)胞中編碼酶的基因的拷貝數(shù)以過表達(dá)該酶，例如通過將基因的額外拷貝整合至宿主 細(xì)胞的基因組中。
[0213] 優(yōu)選的重組微生物可以是天然能夠產(chǎn)生GGPP的重組微生物。
[0214] 合適的重組微生物可以在本領(lǐng)域已知的任意合適的碳源上生長并將其轉(zhuǎn)換為一 種或更多種甜菊糖苷。所述重組微生物可直接轉(zhuǎn)換植物生物質(zhì)、纖維素、半纖維素、果膠、鼠 李糖、半乳糖、海藻糖、麥芽糖、麥芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和 甘油。因此，一種優(yōu)選的宿主生物體表達(dá)酶，例如將纖維素轉(zhuǎn)換為葡萄糖單體所需的纖維素 酶（內(nèi)纖維素酶和外纖維素酶）、將半纖維素轉(zhuǎn)換為木糖和阿拉伯糖單體所需的半纖維素酶 (例如內(nèi)木聚糖酶、外木聚糖酶、阿拉伯糖酶）、能夠?qū)⒐z轉(zhuǎn)換為葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸 的果膠酶或者能夠?qū)⒌矸坜D(zhuǎn)換為葡萄糖單體的淀粉酶。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)換的 碳源選自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖和甘油。所述宿主細(xì)胞可以是，例如如在W003/ 062430、W006/009434、EP1499708B1、W02006096130或 W004/099381 中描述的真核宿主細(xì)胞。
[0215] 如上所述的重組微生物可被用在生產(chǎn)甜菊糖苷的方法中，所述方法包括:在合適 的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵經(jīng)轉(zhuǎn)化的合適的重組微生物(如上文所述）；以及任選地回收二萜和/ 或二萜糖苷。
[0216] 在生產(chǎn)二萜和/或二萜糖苷的方法中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基可以是任何能使特定真核 宿主細(xì)胞生長的適合的培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基的基本元素是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并可 針對所選宿主細(xì)胞進(jìn)行修改。
[0217]優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基包括選自植物生物質(zhì)、纖維素、半纖維素、果膠、鼠李糖、半乳 糖、海藻糖、果糖、麥芽糖、麥芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖、脂肪 酸、甘油三酯和甘油的碳源。優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基還包括氮源，例如尿素或者銨鹽(例如硫酸 銨、氯化銨、硝酸銨或磷酸銨）。
[0218] 可以以分批、補(bǔ)料分批或連續(xù)的模式實(shí)施合適的發(fā)酵方法。也可采用分步水解發(fā) 酵(SHF)法或同時(shí)糖化發(fā)酵(SSF)法。為了達(dá)到最佳生產(chǎn)力，還可以將這些發(fā)酵方法的模式 結(jié)合。在發(fā)酵方法中，如果使用淀粉、纖維素、半纖維素或果膠作為碳源，那么SSF方法可能 特別有吸引力，該方法中可能需要加入水解酶，例如纖維素酶、半纖維素酶或果膠酶以水解 底物。
[0219] 在制備甜菊糖苷的方法中使用的重組微生物可以是任何如上文所定義的適合的 微生物。在生產(chǎn)二萜和/或二萜糖苷的方法中，使用本文所述重組真核微生物可能是有利 的，因?yàn)榇蟛糠终婧思?xì)胞不需要無菌條件來增殖而且對噬菌體感染不敏感。此外，真核宿主 細(xì)胞可以在低PH條件下生長以避免細(xì)菌污染。
[0220] 重組微生物可以是兼性厭氧微生物。在有氧條件下，兼性厭氧微生物能夠增殖至 高細(xì)胞濃度。然后可以在高細(xì)胞密度時(shí)進(jìn)行厭氧階段，高細(xì)胞密度不僅大幅度減少了需要 的發(fā)酵體積，而且可以最小化好氧微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。
[0221] 生產(chǎn)甜菊糖苷的發(fā)酵方法可以是有氧的或厭氧的發(fā)酵方法。
[0222] 厭氧發(fā)酵方法在本文中可被定義為:在沒有氧氣或?qū)嵸|(zhì)上沒有氧氣可用（優(yōu)選的 少于5、2.5或lmmol/L/h)的條件下運(yùn)行的發(fā)酵方法，其中有機(jī)分子起著電子供體和電子受 體的作用。發(fā)酵方法還可以首先在有氧條件下運(yùn)行，然后在無氧條件下運(yùn)行。
[0223] 還可以在氧限制(oxygen-limited)或微有氧(micro-aerobical)條件下運(yùn)行所述 發(fā)酵方法?；蛘?，可以先在有氧條件下、然后在氧限制條件下運(yùn)行所述發(fā)酵方法。氧限制發(fā) 酵方法指的是耗氧量受到從氣體輸送至液體的氧氣的限制。氧限制的程度取決于進(jìn)入氣流 的量和組分以及所使用的發(fā)酵設(shè)備的實(shí)際混合/傳質(zhì)性能。
[0224] 發(fā)酵方法中可以在宿主細(xì)胞的生長期或靜止(穩(wěn)態(tài))期生產(chǎn)甜菊糖苷，或者在這兩 個(gè)階段均生產(chǎn)甜菊糖苷?？梢栽诓煌臏囟认逻\(yùn)行所述發(fā)酵方法。
[0225] 可以在最適合重組微生物的溫度下生產(chǎn)甜菊糖苷。最適宜的生長溫度可因各種被 轉(zhuǎn)化的細(xì)胞而異，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。所述最適宜的溫度可能比最適合野生型 生物體的溫度高，以便生物體在非無菌條件下，在感染敏感性最小和冷卻成本最低時(shí)高效 生長?；蛘?，可以在并非最適合重組微生物生長的溫度下實(shí)施該方法。
[0226] 在生產(chǎn)二萜或二萜糖苷的方法中，重組微生物的生長溫度可以高于20 °C、22 °C、25 °C、28°C或高于30°C、35°C或高于37°C、40°C、42°C，優(yōu)選地低于45°C。然而在二萜或二萜糖 苷的產(chǎn)生階段，最適宜的溫度可能低于平均溫度以優(yōu)化生物質(zhì)的穩(wěn)定性。這個(gè)階段的溫度 可以低于45°C，例如低于42°(：、40°(