殺蟲蛋白的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種殺蟲蛋白的用途，特別是涉及一種Cry2Ab蛋白質(zhì)通過在植物中 表達(dá)來控制桃蛀螟為害植物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 桃駐螟（Conogethespunctiferalis)屬鱗翅目螟蛾科，為雜食性害蟲，除危害玉 米、高粱等作物外，還危害桃、柿、板栗等果樹，廣泛分布于我國境內(nèi)，北起黑龍江、內(nèi)蒙古， 南至臺(tái)灣地區(qū)、海南、廣東、廣西、云南南緣，東接前蘇聯(lián)東境、朝鮮北境，西面自山西、陜西 西斜至寧夏、甘肅后，折入四川、云南、西藏。危害玉米時(shí)，主要蛀食雌穗，也可蛀莖，受害株 率達(dá)30 % -80 %;危害高粱時(shí)，初孵幼蟲蛀入高粱幼嫩籽粒內(nèi)，用糞便或食物殘?jiān)芽诜庾。?在其內(nèi)蛀害，吃空一粒又轉(zhuǎn)一粒直至三齡前，三齡后吐絲結(jié)網(wǎng)綴合小穗中間留有隧道，在里 面穿行啃食籽粒，嚴(yán)重的把高粱粒蛀食一空。此外還可蛀桿，危害情況類似玉米螟。
[0003]玉米是中國重要的糧食作物，每年因桃蛀螟造成的糧食損失巨大，更甚者影響到 當(dāng)?shù)厝丝诘纳鏍顩r。為了防治桃蛀螟，人們通常采用的主要防治方法有：農(nóng)業(yè)防治、化學(xué) 防治和生物防治。
[0004] 農(nóng)業(yè)防治是把整個(gè)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)多因素的綜合協(xié)調(diào)管理，調(diào)控作物、害蟲、環(huán)境因 素、創(chuàng)造一個(gè)有利于作物生長而不利于桃蛀螟發(fā)生的農(nóng)田生態(tài)環(huán)境。如利用處理桃蛀螟越 冬寄主、拾毀落果和摘除蟲果、改革耕作制度、種植抗桃蛀螟品種和種植誘集田等措施降低 桃蛀螟的危害。因農(nóng)業(yè)防治必須服從作物布局和增產(chǎn)的要求，應(yīng)用有一定的局限性，不能作 為應(yīng)急措施，在桃蛀螟爆發(fā)時(shí)就顯得無能為力。
[0005] 化學(xué)防治即農(nóng)藥防治，是利用化學(xué)殺蟲劑來殺滅害蟲，是桃蛀螟綜合治理的重要 組成部分，它具有快速、方便、簡便和高經(jīng)濟(jì)效益的特點(diǎn)，特別是桃蛀螟大發(fā)生的情況下，是 必不可少的應(yīng)急措施，它可以在桃蛀螟造成危害前將其消滅。目前化學(xué)防治方法主要有化 學(xué)誘殺、藥液噴霧等。但化學(xué)防治也有其局限性，如使用不當(dāng)往往會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物發(fā)生藥害、 害蟲產(chǎn)生抗藥性，以及殺傷天敵、污染環(huán)境，使農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞和農(nóng)藥殘留對人、畜 的安全構(gòu)成威脅等不良后果。
[0006] 生物防治是利用某些有益生物或生物代謝產(chǎn)物來控制害蟲種群數(shù)量，以達(dá)到降 低或消滅害蟲的目的。其特點(diǎn)是對人、畜安全，對環(huán)境污染少，對某些害蟲可達(dá)到長期控制 的目的；但是效果常不穩(wěn)定，并且不論桃蛀螟發(fā)生輕重均需同樣投資進(jìn)行。
[0007] 為了解決農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治在實(shí)際應(yīng)用中的局限性，科學(xué)家們經(jīng)過 研究發(fā)現(xiàn)將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得一些抗蟲轉(zhuǎn)基因植物以防治植 物蟲害。Cry2Ab殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是由蘇云金芽孢桿菌庫斯塔基亞種 (Bacillusthuringiensissubsp.kurstaki，B.t.k.)產(chǎn)生的不溶性伴抱結(jié)晶蛋白。
[0008]Cry2Ab蛋白被昆蟲攝入進(jìn)入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性pH環(huán) 境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉(zhuǎn)變成活性片段；活性片段和昆蟲中 腸上皮細(xì)胞膜上表面上受體結(jié)合，插入腸膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)穿孔病灶，破壞細(xì)胞膜內(nèi)外的 滲透壓變化及pH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導(dǎo)致其死亡。
[0009] 已證明轉(zhuǎn)Cry2Ab基因的植株可以抵抗玉米螟、棉鈴蟲等鱗翅目（Lepidoptera)害 蟲的侵害，然而，至今尚無關(guān)于通過產(chǎn)生表達(dá)Cry2Ab蛋白的轉(zhuǎn)基因植株來控制桃蛀螟對植 物危害的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種殺蟲蛋白的用途，首次提供了通過產(chǎn)生表達(dá)Cry2Ab蛋 白的轉(zhuǎn)基因植株來控制桃蛀螟對植物危害的方法，且有效克服現(xiàn)有技術(shù)農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防 治和生物防治等技術(shù)缺陷。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種控制桃蛀螟害蟲的方法，包括將桃蛀螟害蟲 至少與Cry2Ab蛋白接觸。
[0012] 進(jìn)一步地，所述Cry2Ab蛋白存在于至少產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白的宿主細(xì)胞中，所述 桃蛀螟害蟲通過攝食所述宿主細(xì)胞至少與所述Cry2Ab蛋白接觸。
[0013] 更進(jìn)一步地，所述Cry2Ab蛋白存在于至少產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白的細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因 植物中，所述桃蛀螟害蟲通過攝食所述細(xì)菌或所述轉(zhuǎn)基因植物的組織至少與所述Cry2Ab 蛋白接觸，接觸后所述桃蛀螟害蟲生長受到抑制和/或?qū)е滤劳?，以?shí)現(xiàn)對桃蛀螟危害植 物的控制。
[0014] 所述轉(zhuǎn)基因植物可以處于任意生育期。
[0015] 所述轉(zhuǎn)基因植物的組織為根、葉片、莖桿、果實(shí)、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
[0016] 所述對桃蛀螟危害植物的控制不因種植地點(diǎn)和/或種植時(shí)間的改變而改變。
[0017] 所述植物來自玉米、向日葵、大豆、高粱、板栗、桃、石榴、蘋果、番茄、茄子、甘蔗、草 坪草、棉花、油菜或草莓。
[0018] 所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述Cry2Ab蛋白的多核苷酸的植物。 [0019]優(yōu)選地，所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。所 述Cry2Ab蛋白的核苷酸序列具有SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。
[0020] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述植物還可以包括至少一種不同于編碼所述Cry2Ab 蛋白的核苷酸的第二種核苷酸。
[0021] 進(jìn)一步地，所述第二種核苷酸編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶 抑制劑、凝集素、a-淀粉酶或過氧化物酶。
[0022] 優(yōu)選地，所述第二種核苷酸編碼CrylA. 105蛋白或Vip3A蛋白。
[0023] 進(jìn)一步地，所述CrylA. 105蛋白的氨基酸序列具有SEQIDN0:3所示的氨基酸序 列。
[0024] 更進(jìn)一步地，所述第二種核苷酸具有SEQIDN0:4所示的氨基酸序列。
[0025] 可選擇地，所述第二種核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
[0026] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種Cry2Ab蛋白質(zhì)控制桃蛀螟害蟲的用途。
[0027] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生控制桃蛀螟害蟲的植物的方法，包括 向所述植物的基因組中引入編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列。
[0028] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生控制桃蛀螟害蟲的植物種子的方法， 包括將由所述方法獲得的第一植株與第二植株雜交，從而產(chǎn)生含有編碼Cry2Ab蛋白的多 核苷酸序列的種子。
[0029] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)控制桃蛀螟害蟲的植物的方法，包 括：
[0030] 種植至少一粒植物種子，所述植物種子的基因組中包括編碼Cry2Ab蛋白的多核 苷酸序列；
[0031] 使所述植物種子長成植株；
[0032] 使所述植株在人工接種桃蛀螟害蟲和/或桃蛀螟害蟲自然發(fā)生危害的條件下生 長，收獲與其他不具有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有減弱的植物損傷 和/或具有增加的植物產(chǎn)量的植株。
[0033] 本發(fā)明中所述的"接觸"，是指昆蟲和/或害蟲觸碰、停留和/或攝食植物、植物器 官、植物組織或植物細(xì)胞，所述植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞既可以是其體內(nèi)表達(dá) 殺蟲蛋白，還可以是所述植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的表面具有殺蟲蛋白和/或 具有產(chǎn)生殺蟲蛋白的微生物。
[0034] 本發(fā)明所述的"控制"和/或"防治"是指桃蛀螟害蟲至少與Cry2Ab蛋白接觸，接 觸后桃蛀螟害蟲生長受到抑制和/或?qū)е滤劳?。進(jìn)一步地，桃蛀螟害蟲通過攝食植物組織 至少與Cry2Ab蛋白接觸，接觸后全部或部分桃蛀螟害蟲生長受到抑制和/或?qū)е滤劳?。?制是指亞致死，即尚未致死但能引起生長發(fā)育、行為、生理、生化和組織等方面的某種效應(yīng)， 如生長發(fā)育緩慢和/或停止。同時(shí)，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以 用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。此外，含有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的控制桃蛀螟害 蟲的植物和/或植物種子，在人工接種桃蛀螟害蟲和/或桃蛀螟害蟲自然發(fā)生危害的條件 下，與非轉(zhuǎn)基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，具體表現(xiàn)包括但不限于改善的莖 桿抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增產(chǎn)等。Cry2Ab蛋白對桃蛀螟的"控制"和/或"防 治"作用是可以獨(dú)立存在的，不因其它可"控制"和/或"防治"桃駐螟害蟲的物質(zhì)的存在而 減弱和/或消失。具體地，轉(zhuǎn)基因植物（含有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列）的任何組 織同時(shí)和/或不同步地，存在和/或產(chǎn)生，Cry2Ab蛋白和/或可控制桃蛀螟害蟲的另一種 物質(zhì)，則所述另一種物質(zhì)的存在既不影響Cry2Ab蛋白對桃蛀螟的"控制"和/或"防治"作 用，也不能導(dǎo)致所述"控制"和/或"防治"作用完全和/或部分由所述另一種物質(zhì)實(shí)現(xiàn)，而 與Cry2Ab蛋白無關(guān)。通常情況下，在大田，桃蛀螟害蟲攝食植物組織的過程短暫且很難用 肉眼觀察到，因此，在人工接種桃蛀螟害蟲和/或桃蛀螟害蟲自然發(fā)生危害的條件下，如轉(zhuǎn) 基因植物（含有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列）的任何組織存在死亡的桃蛀螟害蟲、和 /或在其上停留生長受到抑制的桃蛀螟害蟲、和/或與非轉(zhuǎn)基因的野生型植株相比具有減 弱的植物損傷，即為實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的方法和/或用途，即通過桃蛀螟害蟲至少與Cry2Ab蛋 白接觸以實(shí)現(xiàn)控制桃蛀螟害蟲的方法和/或用途。
[0035] 在本發(fā)明中，Cry2Ab蛋白在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)可以伴隨著一個(gè)或多個(gè)Cry 類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉(zhuǎn)基因 植物中共同表達(dá)可以通過遺傳工程使植物包含并表達(dá)所需的基因來實(shí)現(xiàn)。另外，一種植物 (第1親本）可以通過遺傳工程操作表達(dá)Cry2Ab蛋白質(zhì)，第二種植物（第2親本）可以通 過遺傳工程操作表達(dá)Cry類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)。通過第1親本和第2親 本雜交獲得表達(dá)引入第1親本和第2親本的所有基因的后代植物。
[0036]RNA干擾（RNAinterference,RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA(double-strandedRNA,dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。因此在本 發(fā)明中可以使用RNAi技術(shù)特異性剔除或關(guān)閉目標(biāo)昆蟲害蟲中特定基因的表達(dá)。
[0037]在分類系統(tǒng)上，一般主要根據(jù)成蟲翅的脈序、連鎖方式和觸角的類型等形態(tài)特征， 將鱗翅目分為亞目、總科、科等，而螟蛾科是鱗翅目中種類最多的科之一，全世界已發(fā)現(xiàn)1 萬種以上，僅中國記錄就有幾千條。大部分螟蛾科昆蟲是農(nóng)作物的害蟲，多數(shù)以蛀莖形式為 害，如二化螟和玉米螟。盡管桃蛀螟與二化螟、玉米螟等同屬于鱗翅目螟蛾科，除了在分類 標(biāo)準(zhǔn)上存在相似性，在其它形態(tài)結(jié)構(gòu)上則存在極大差異；就好比植物中的草莓與蘋果一樣 (同屬于薔薇目薔薇科），它們都有花兩性，輻射對稱，花瓣5片等特征，但是其果實(shí)以及植 株形態(tài)卻是千差萬別。桃蛀螟不管是從幼蟲形態(tài)還是成蟲形態(tài)上來看，都具有其獨(dú)特的特 征。如桃蛀螟又被稱為豹紋蛾，是因?yàn)槠涑上x翅上有豹紋。而與其同屬的玉米螟，翅上完全 沒有豹紋，而又有一些波浪紋。成蟲階段是昆蟲要行使交配繁殖的重要階段，翅上的花紋配 合釋放的性信息素，來吸引同伴，進(jìn)而完成交配與繁殖后代。所以外表上的小小差異，其實(shí) 體現(xiàn)出的是個(gè)體繁殖以及群體繁衍上的根本區(qū)別。