[0038]同屬螟蛾科的昆蟲不僅在形態(tài)特征上存在較大差異，同時在取食習性上，也存在 差異。例如同為螟蛾科的玉米螟主要為害禾本科的玉米，極少為害其它闊葉類作物，尤其 是從未有報道有玉米螟為害桃、石榴、蘋果等果樹作物。而桃蛀螟除了為害玉米之外，還大 量為害向日葵、大豆以及桃、石榴等非禾本科的作物。取食習性的不同，也暗示著體內(nèi)消化 系統(tǒng)所產(chǎn)生的酶和受體蛋白不同。而消化道中產(chǎn)生的酶是Bt基因起作用的關(guān)鍵點，只有 能夠與特異性Bt基因相結(jié)合的酶或受體蛋白，才有可能使得某個Bt基因?qū)υ摵οx具有抗 蟲效果。越來越多的研究表明，同目不同科、甚至同科不同種的昆蟲對同種Bt蛋白的敏 感性表現(xiàn)不同。例如Vip3Aa基因?qū)γ昕频亩–hilosuppressalis)、亞洲玉米螟 (Ostriniafurnacalis)都表現(xiàn)出了抗蟲活性，但是對于同屬螟蛾科的印度谷螟（Plodia interpunctella)以及歐洲玉米螟（Ostrinianubilalis)卻沒有抗蟲效果。上述四種害蟲 均屬于鱗翅目螟蛾科，但同種Bt蛋白對四種螟蛾科害蟲表現(xiàn)出不同的抗性效果。尤其是歐 洲玉米螟和亞洲玉米螟在分類上甚至同屬于螟蛾科Ostrinia屬（同目同科同屬），但是其 對同種Bt蛋白的反應卻是截然不同的，更加充分說明了Bt蛋白與昆蟲體內(nèi)酶和受體的相 互作用方式是復雜且難以預料的。
[0039]本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物 細胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。
[0040]本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整"基因"，在所需宿主細胞中編碼 蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認識到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置 于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。
[0041]本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與 另一條鏈互補，反之亦然。由于DNA在植物中復制產(chǎn)生了DNA的其它互補鏈。這樣，本發(fā)明 包括對序列表中示例的多核苷酸及其互補鏈的使用。本領(lǐng)域常使用的"編碼鏈"指與反義 鏈結(jié)合的鏈。為了在體內(nèi)表達蛋白質(zhì)，典型將DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mRNA的互補鏈，它 作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mRNA實際上是從DNA的"反義"鏈轉(zhuǎn)錄的。"有義"或"編碼"鏈有 一系列密碼子（密碼子是三個核苷酸，一次讀三個可以產(chǎn)生特定氨基酸），其可作為開放閱 讀框（ORF)閱讀來形成目的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括與示例的DNA有相當功能的RNA。
[0042]本發(fā)明中核酸分子或其片段在嚴格條件下與本發(fā)明Cry2Ab基因雜交。任何常規(guī) 的核酸雜交或擴增方法都可以用于鑒定本發(fā)明Cry2Ab基因的存在。核酸分子或其片段在 一定情況下能夠與其他核酸分子進行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個核酸分子能形成反 平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進行特異性雜交。如果兩個核 酸分子顯示出完全的互補性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的"互補物"。本發(fā) 明中，當一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應核苷酸互補時，則稱這 兩個核酸分子顯示出"完全互補性"。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從 而使它們在至少常規(guī)的"低度嚴格"條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子為"最低 程度互補"。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的 "高度嚴格"條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子具有"互補性"。從完全互補性中 偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個核酸分 子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補性，以使得在所采用的特定 溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0043]本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴格條件下能夠 和相匹配的另一段核酸分子的互補鏈發(fā)生特異性雜交。促進DNA雜交的適合的嚴格條件， 例如，大約在45°C條件下用6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)處理，然后在50°C條件下用 2. 0XSSC洗滌，這些條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選 自低度嚴格條件的約2. 0XSSC、50°C到高度嚴格條件的約0. 2XSSC、50°C。此外，洗滌步驟 中的溫度條件可以從低度嚴格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴格條件的約65°C。溫度條 件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本 發(fā)明所述嚴格條件可為在6XSSC、0. 5%SDS溶液中，在65°C下與SEQIDN0:2發(fā)生特異性 雜交，然后用2XSSC、0. 1 %SDS和1XSSC、0. 1 %SDS各洗膜1次。
[0044] 因此，具有抗蟲活性并在嚴格條件下與本發(fā)明SEQIDN0:2雜交的序列包括在本 發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40 % -50 %同源，大約60 %、65 %或70 %同源，甚 至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 更大的序列同源性。
[0045] 本發(fā)明中所述的基因和蛋白質(zhì)不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定 示例的蛋白質(zhì)的殺蟲活性特征的部分和/或片段（包括與全長蛋白質(zhì)相比在內(nèi)和/或末端 缺失）、變體、突變體、取代物（有替代氨基酸的蛋白質(zhì)）、嵌合體和融合蛋白。所述"變體" 或"變異"是指編碼同一蛋白或編碼有殺蟲活性的等價蛋白的核苷酸序列。所述"等價蛋 白"是指與權(quán)利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗桃蛀螟害蟲的生物活性的蛋白。
[0046] 本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的"片段"或"截短"是指涉及的原始DNA或 蛋白序列（核苷酸或氨基酸）的一部分或其人工改造形式（例如適合植物表達的序列），前 述序列的長度可存在變化，但長度足以確保（編碼）蛋白質(zhì)為昆蟲毒素。
[0047]使用標準技術(shù)可以修飾基因和容易的構(gòu)建基因變異體。例如，本領(lǐng)域熟知制造點 突變的技術(shù)。又例如美國專利號5605793描述了在隨機斷裂后使用DNA重裝配產(chǎn)生其它分 子多樣性的方法?？梢允褂蒙虡I(yè)化核酸內(nèi)切酶制造全長基因的片段，并且可以按照標準程 序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶諸如Bal31或定點誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切 除核苷酸。還可以使用多種限制性內(nèi)切酶獲取編碼活性片段的基因?？梢允褂玫鞍酌钢苯?獲得這些毒素的活性片段。
[0048] 本發(fā)明可以從B.t.分離物和/或DNA文庫衍生出等價蛋白和/或編碼這些等價 蛋白的基因。有多種方法獲取本發(fā)明的殺蟲蛋白。例如，可以使用本發(fā)明公開和要求保護 的殺蟲蛋白的抗體從蛋白質(zhì)混合物鑒定和分離其它蛋白。特別地，抗體可能是由蛋白最恒 定和與其它B.t.蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通過免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測 定（ELISA)或western印跡方法使用這些抗體專一地鑒定有特征活性的等價蛋白?？墒褂?本領(lǐng)域標準程序容易的制備本發(fā)明中公開的蛋白或等價蛋白或這類蛋白的片段的抗體。然 后可以從微生物中獲得編碼這些蛋白的基因。
[0049] 由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的氨基酸序列。產(chǎn) 生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平內(nèi)。 這些不同的DNA序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述"基本上相同的"序列是指有氨基酸取 代、缺失、添加或插入但實質(zhì)上不影響殺蟲活性的序列，亦包括保留殺蟲活性的片段。
[0050] 本發(fā)明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選這種氨基酸 變化為：小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺 失，通常約1-30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個甲硫氨酸 殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。
[0051] 保守取代的實例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代：堿性氨基酸（如精氨酸、賴氨 酸和組氨酸）、酸性氨基酸（如谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸（如谷氨酰胺、天冬酰胺）、 疏水性氨基酸（如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）、芳香氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨 酸），以及小分子氨基酸（如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸）。通常不改變特定 活性的那些氨基酸取代在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，并且已由，例如，N. Neurath和R. L. Hill 在1979年紐約學術(shù)出版社（Academic Press)出版的《Protein》中進行了描述。最常見的 互換有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thu/Ser，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/ Phe，Ala/Pro, Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly，以及它們相反的 互換。
[0052] 對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見地，這種取代可以在對分子功能起重要作用 的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇 不被取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變進行 鑒定（如參見，Cunningham和Wells，1989,Science244:1081-1085)。后一技術(shù)是在分子 中每一個帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的抗蟲活性，從而確定對該分子 活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可以通過其三維結(jié)構(gòu)的分析來測 定，這種三維結(jié)構(gòu)可由核磁共振分析、結(jié)晶學或光親和標記等技術(shù)測定（參見，如deVos 等，1992,Science255 :306-312;Smith等，1992,J.Mol.Biol224:899-904;Wlodaver等， 1992,FEBSLetters309 :59_64)。
[0053] 在本發(fā)明中，Cry2Ab蛋白包括但不限于序列1，與序列1所示的氨基酸序列具有 一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列類似性/相同性典型 的大于78%，優(yōu)選的大于85%，更優(yōu)選的大于90%，甚至更優(yōu)選的大于95%，并且可以大于 99%。也可以根據(jù)更特定的相同性和/或類似性范圍定義本發(fā)明的優(yōu)選的多核苷酸和蛋白 質(zhì)。例如與本發(fā)明示例的序列有 78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性和/或類 似性。
[0054] 在本發(fā)明中，產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白的轉(zhuǎn)基因植物包括但不限于Mon89034轉(zhuǎn)基因 玉米事件和/或包含Mon89034轉(zhuǎn)基因玉米事件的植物材料（如在CN101495635A所描述 的）、M0N87751轉(zhuǎn)基因大豆事件和/或包含M0N87751轉(zhuǎn)基因大豆事件的植物材料（如在 USDAAPHIS非管制狀態(tài)申請13-337-01p所描述的）、或者Monl5985轉(zhuǎn)基因棉花事件和/ 或包含Monl5985轉(zhuǎn)基因棉花事件的植物材料（如在CN101413028B所描述的），其均可以實 現(xiàn)本發(fā)明的方法和/或用途，即通過桃蛀螟害蟲至少與Cry2Ab蛋白接觸以實現(xiàn)控制桃蛀螟 害蟲的方法和/或用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，使上述轉(zhuǎn)基因事件中的Cry2Ab蛋白在 不同植物中表達亦能實現(xiàn)本發(fā)明的方法和/或用途。更具體地，所述Cry2Ab蛋白存在于至 少產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白的轉(zhuǎn)基因