ry2Ab-CrylA. 105核苷酸序列的大豆植株；同時以野生型大豆植株 作為對照。
[0109] 對于農(nóng)桿菌介導的大豆轉(zhuǎn)化,簡要地，將成熟的大豆種子在大豆萌發(fā)培養(yǎng)基（B5 鹽3.lg/L，B5維他命，蔗糖20g/L，瓊脂8g/L，pH5. 6)中進行萌發(fā)，將種子接種于萌發(fā)培養(yǎng) 基上，按以下條件培養(yǎng)：溫度25±1°C;光周期（光/暗）為16/8h。萌發(fā)4-6天后取鮮綠的 子葉節(jié)處膨大的大豆無菌苗，在子葉節(jié)下3-4毫米處切去下胚軸，縱向切開子葉，去頂芽、 側(cè)芽和種子根。用解剖刀的刀背在子葉節(jié)處進行創(chuàng)傷，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸創(chuàng)傷過的子葉 節(jié)組織，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)ry2Ab核苷酸序列和/或Cry2Ab-CrylA. 105核苷酸序列傳遞 至創(chuàng)傷過的子葉節(jié)組織（步驟1 :侵染步驟）在此步驟中，子葉節(jié)組織優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸 浮液（〇D66CI= 0?5-0. 8,侵染培養(yǎng)基（MS鹽2. 15g/L、B5維他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、 乙酰丁香酮（AS)40mg/L、2-嗎啉乙磺酸（MES)4g/L、玉米素（ZT)2mg/L，pH5. 3)中以啟動接 種。子葉節(jié)組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時期（3天）（步驟2 :共培養(yǎng)步驟）。優(yōu)選地，子葉節(jié) 組織在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基（MS鹽4. 3g/L、B5維他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2-嗎 啉乙磺酸（MES)4g/L、玉米素2mg/L、瓊脂8g/L，pH5.6)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可以有 一個選擇性的"恢復"步驟。在"恢復"步驟中，恢復培養(yǎng)基（B5鹽3.lg/L、B5維他命、2-嗎 啉乙磺酸（MES)lg/L、鹿糖30g/L、玉米素（ZT)2mg/L、瓊脂8g/L，頭孢霉素150mg/L，谷氨酸 100mg/L，天冬氨酸100mg/L，pH5. 6)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素（頭孢 霉素），不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑（步驟3 :恢復步驟）。優(yōu)選地，子葉節(jié)再生的組織塊在 有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細胞提供恢復期。接 著，子葉節(jié)再生的組織塊在含選擇劑（潮霉素）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷 組織（步驟4 :選擇步驟）。優(yōu)選地，子葉節(jié)再生的組織塊在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基（B5 鹽3.lg/L、B5維他命、2-嗎啉乙磺酸（MES)lg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤（6-BAP)lmg/L、 瓊脂8g/L，頭孢霉素150mg/L，谷氨酸100mg/L，天冬氨酸100mg/L，潮霉素50mg/L，pH5. 6) 上培養(yǎng)，導致轉(zhuǎn)化的細胞選擇性生長。然后，轉(zhuǎn)化的細胞再生成植物（步驟5:再生步驟）， 優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的子葉節(jié)再生的組織塊在固體培養(yǎng)基（B5分化培養(yǎng)基 和B5生根培養(yǎng)基）上培養(yǎng)以再生植物。
[0110] 篩選得到的抗性組織塊轉(zhuǎn)移到所述B5分化培養(yǎng)基（B5鹽3.lg/L、B5維他命、2-嗎 啉乙磺酸（MES)lg/L、鹿糖30g/L、玉米素（ZT)lmg/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、谷氨酸 50mg/L、天冬氨酸50mg/L、赤霉素lmg/L、生長素lmg/L、潮霉素50mg/L，pH5.6)上，25°C下 培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述B5生根培養(yǎng)基（B5鹽3.lg/L、B5維他命、2-嗎啉 乙磺酸（MES)lg/L、鹿糖30g/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、吲哚-3- 丁酸（IBA)lmg/L)， 在生根培養(yǎng)上，25°C下培養(yǎng)至約10cm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實。在溫室中，每天于26°C下培 養(yǎng)16小時，再于20°C下培養(yǎng)8小時。
[0111] 第四實施例、用TaqMan驗證轉(zhuǎn)基因植株
[0112] 分別取轉(zhuǎn)入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入Cry2Ab_CrylA. 105核苷酸序列 的玉米植株的葉片約l〇〇mg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組 DNA，通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測Cry2Ab基因和CrylA. 105基因的拷貝數(shù)。同 時以野生型玉米植株作為對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設3次重復，取平均值。
[0113] 檢測Cry2Ab基因和CrylA. 105基因拷貝數(shù)的具體方法如下：
[0114] 步驟11、分別取轉(zhuǎn)入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入Cry2Ab_CrylA. 105核苷 酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各l〇〇mg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個 樣品取3個重復；
[0115] 步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA，具 體方法參考其產(chǎn)品說明書；
[0116] 步驟13、用NanoDrop2000(Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃 度；
[0117] 步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為 80-100ng/u1；
[0118] 步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知 拷貝數(shù)的樣品作為標準品，以野生型玉米植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復，取其平 均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是：
[0119] 以下引物和探針用來檢測Cry2Ab核苷酸序列：
[0120]引物 1:CTGATACCCTTGCTCGCGTC如序列表中SEQ ID N0:8所示；
[0121]引物2 :CACTTGGCGGITGAACTCCTC如序列表中SEQ ID N0:9所示；
[0122]探針 1:CGCTGAGCTGACGGGTCTGCAAG如序列表中SEQ ID NO:10 所示；
[0123] 以下引物和探針用來檢測CrylA. 105核苷酸序列：
[0124]引物3 :GCGCATCCAGTTCAACGAC如序列表中SEQ ID N0:11 所示；
[0125]引物 4:GITCTGGACGGCGAAGAGTG如序列表中SEQ ID NO:12 所示；
[0126]探針2 :TGAACAGCGCCCTGACCACCG如序列表中SEQ ID NO:13 所示；
[0127] PCR反應體系為：
[0128]
【主權(quán)項】
1. 一種控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，包括將桃蛀螟害蟲至少與Cry2Ab蛋白接 觸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述Cry2Ab蛋白存在 于至少產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白的宿主細胞中，所述桃蛀螟害蟲通過攝食所述宿主細胞至少 與所述Cry2Ab蛋白接觸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述Cry2Ab蛋白存在 于至少產(chǎn)生所述Cry2Ab蛋白的細菌或轉(zhuǎn)基因植物中，所述桃蛀螟害蟲通過攝食所述細菌 或所述轉(zhuǎn)基因植物的組織至少與所述Cry2Ab蛋白接觸，接觸后所述桃蛀螟害蟲生長受到 抑制和/或?qū)е滤劳?，以實現(xiàn)對桃蛀螟危害植物的控制。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物可以 處于任意生育期。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物的組 織為根、葉片、莖桿、果實、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述對桃蛀螟危害植 物的控制不因種植地點和/或種植時間的改變而改變。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3至6任一項所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述植物來 自玉米、向日葵、大豆、高粱、板栗、桃、石榴、蘋果、番茄、茄子、甘蔗、草坪草、棉花、油菜或草 毒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2至7任一項所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述接觸步 驟之前的步驟為種植含有編碼所述Cry2Ab蛋白的多核苷酸的植物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述 Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述Cry2Ab蛋白的核 苷酸序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求2至10任一項所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述植物 還可以包括至少一種不同于編碼所述Cry2Ab蛋白的核苷酸的第二種核苷酸。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸 編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素 、α -淀粉酶或過氧化物 酶。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸 編碼CrylA. 105蛋白或Vip3A蛋白。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述Cry 1A. 105蛋白 的氨基酸序列具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸 具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
16. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的控制桃蛀螟害蟲的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸 為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
17. -種Cry2Ab蛋白質(zhì)控制桃蛀螟害蟲的用途。
18. -種產(chǎn)生控制桃蛀螟害蟲的植物的方法，其特征在于，包括向所述植物的基因組中 引入編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列。
19. 一種產(chǎn)生控制桃蛀螟害蟲的植物種子的方法，其特征在于，包括將由權(quán)利要求18 所述方法獲得的第一植株與第二植株雜交，從而產(chǎn)生含有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序 列的種子。
20. -種培養(yǎng)控制桃蛀螟害蟲的植物的方法，其特征在于，包括： 種植至少一粒植物種子，所述植物種子的基因組中包括編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸 序列； 使所述植物種子長成植株； 使所述植株在人工接種桃蛀螟害蟲和/或桃蛀螟害蟲自然發(fā)生危害的條件下生長，收 獲與其他不具有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有減弱的植物損傷和/或 具有增加的植物產(chǎn)量的植株。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種殺蟲蛋白的用途，所述控制桃蛀螟害蟲的方法包括：將桃蛀螟害蟲至少與Cry2Ab蛋白接觸。本發(fā)明通過植物體內(nèi)產(chǎn)生能夠殺死桃蛀螟的Cry2Ab蛋白來控制桃蛀螟害蟲；與現(xiàn)有技術(shù)使用的農(nóng)業(yè)防治方法、化學防治方法和生物防治方法相比，本發(fā)明對植物進行全生育期、全植株的保護以防治桃蛀螟害蟲的侵害，且無污染、無殘留，效果穩(wěn)定、徹底，簡單、方便、經(jīng)濟。
【IPC分類】A01N47-44, A01H1-02, A01H5-00, A01P7-04, C12N15-84, A01G13-00, A01H4-00, A01G1-00
【公開號】CN104621171
【申請?zhí)枴緾N201510048338
【發(fā)明人】李建勇, 李梅, 龐潔
【申請人】北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司生物技術(shù)中心
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月30日