為少于約1 %的差別，或者少于約5 %的差別，或者少于約10 %的差 另IJ，或者大于約10 %的差別，或者大于約20 %的差別，或者大于約50 %的差別，或者大于約 90%的差別。所述接觸可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。確定所述細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的方法為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所知曉的，并且本文公開(kāi)了這樣的例子，如試驗(yàn)#3和試驗(yàn)#4。另一方面，測(cè)試制劑與 第三細(xì)胞樣品或第三組織樣品接觸，所述第三細(xì)胞樣品或第三組織樣品含有與對(duì)照樣品和 測(cè)試樣品對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞或組織并選擇治療第二細(xì)胞樣品和第二組織樣品但對(duì)第三樣品 沒(méi)有副作用的制劑。就本文描述的試驗(yàn)?zāi)康亩?，合適的細(xì)胞或組織為涉及過(guò)度增殖障礙 (例如癌癥或本文所述的其它疾?。┑募?xì)胞或組織。這樣的例子包括，但不限于：由活組織 檢查、血液、乳腺細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、肝臟細(xì)胞或滑液得到的癌癥細(xì)胞或組織。一方面，所述樣 品包括原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)腫瘤細(xì)胞（膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤）、全身性癌癥的 CNS轉(zhuǎn)移癌癥細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、造血癌癥細(xì)胞或卵巢癌細(xì)胞。
[0128] 使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法（包括，但不限于細(xì)胞活力檢測(cè)或凋亡評(píng)價(jià)）確 定測(cè)試組合物的療效。
[0129] 另一方面，試驗(yàn)需要至少兩種細(xì)胞類型，第一種為合適的對(duì)照細(xì)胞。
[0130] 試驗(yàn)還用于預(yù)測(cè)受治者是否受到本發(fā)明的合理治療，所述試驗(yàn)通過(guò)將組合物遞送 至含有待治療的細(xì)胞的樣品以及檢測(cè)隨病變變化的治療來(lái)進(jìn)行。一方面，所述細(xì)胞或組織 通過(guò)活組織檢查從受治者或患者獲得。申請(qǐng)人提供用于確定病理細(xì)胞或患者是否受到提供 至少一種本發(fā)明的組合物的療法的合理治療的試劑盒和使用說(shuō)明書(shū)。
[0131] 在另一種實(shí)施方式中，第三靶細(xì)胞用作陽(yáng)性對(duì)照，因?yàn)槠浣邮苡行Я康慕M合物，所 述組合物已表現(xiàn)出有效。
[0132] 測(cè)試細(xì)胞可在小的多孔板中生長(zhǎng)，并用于檢測(cè)測(cè)試化合物的生物活性。就本發(fā)明 的目的而言，成功的候選藥物可阻斷病原體生長(zhǎng)或殺死病原體，但對(duì)對(duì)照細(xì)胞類型無(wú)害。
[0133] 本文進(jìn)一步提供通過(guò)這種方法識(shí)別的化合物、制劑及其組合。
[0134] 下列實(shí)施例意于舉例說(shuō)明，但不限制本發(fā)明。
[0135] 試驗(yàn)
[0136] 試驗(yàn)#1-體外效力
[0137] 當(dāng)前，腦瘤通過(guò)靜脈注射或口服化療來(lái)治療。由于血腦屏障阻礙了常規(guī)化療通過(guò) 這兩個(gè)途徑的充分遞送，所以腦癌在很大程度上仍然是無(wú)法治療的。POH通過(guò)鼻部吸入被遞 送至腦瘤。已證明其在病人體內(nèi)被安全耐受，并在具有惡性膠質(zhì)瘤的患者體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤尺 寸放射性減小。認(rèn)為遞送機(jī)理是通過(guò)嗅束遞送以及通過(guò)鼻血管系統(tǒng)全身性遞送。
[0138] 認(rèn)為POH作用的機(jī)理是通過(guò)抑制小G蛋白合成（包括Ras)。除了惡性膠質(zhì)瘤之 夕卜，已證明POH還有效對(duì)抗一些全身性惡性腫瘤，包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤。目 前通過(guò)鼻吸入器每天給藥四次，發(fā)現(xiàn)耐受良好，副作用最小。
[0139] POH從未用于聯(lián)合治療。申請(qǐng)人確定了 POH可用于與常規(guī)化療劑（例如替莫唑胺， TMZ;圖1)聯(lián)合，或與更多的試驗(yàn)制劑（圖2;即二甲基-塞來(lái)考昔）聯(lián)合，從而在膠質(zhì)瘤細(xì) 胞中誘導(dǎo)比單獨(dú)使用任一藥物更大的細(xì)胞毒性。圖1A和圖1C說(shuō)明在MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn) 中，TMZ與0. 01% POH聯(lián)合具有至少一種累加效應(yīng)。這種效應(yīng)對(duì)U-87膠質(zhì)瘤細(xì)胞（圖1B) 和A-172TMZ耐受細(xì)胞（圖1D)來(lái)說(shuō)不太顯著。當(dāng)POH與DMC聯(lián)合時(shí)，這種聯(lián)合效應(yīng)更加顯 著。圖2A至圖2C說(shuō)明了對(duì)U-251，U-87和A-172細(xì)胞系的至少一種累加效應(yīng)。與DMC聯(lián) 合，POH和DMC甚至對(duì)A-172TMZ耐受細(xì)胞有效。U-251獲自MCI-Frederick，是CNS人膠質(zhì) 母細(xì)胞瘤細(xì)胞系。參見(jiàn) dtp. nci. nih. gov/docs/misc/common_files/cell_list. html，上次 訪問(wèn)于2009年2月5日。U-251也可獲自ATCC。
[0140] 鼻內(nèi)遞送提供用于將治療劑遞送至腦的實(shí)用的、非創(chuàng)傷的方法，因?yàn)樾嵊X(jué)神經(jīng)和 三叉神經(jīng)提供了獨(dú)特的解剖學(xué)上的連結(jié)。這些神經(jīng)連結(jié)鼻粘膜和CNS，使它們能夠檢測(cè)到氣 味和其它化學(xué)刺激。鼻內(nèi)給藥藥物采用細(xì)胞外途徑穿過(guò)周圍神經(jīng)通道在幾分鐘之內(nèi)到達(dá)腦 和脊髓的薄壁組織和/或腦脊髓液（CSF)。除了繞過(guò)BBB之外，鼻內(nèi)遞送的優(yōu)點(diǎn)還包括迅速 遞送到CNS、避免肝臟的首過(guò)藥物代謝以及消除全身性遞送的需要，由此減少不期望的全身 性副作用。鼻內(nèi)遞送還提供無(wú)痛和便于患者自我給藥的特征，所述特征促進(jìn)鼻內(nèi)遞送在將 治療劑遞送進(jìn)入CNS方面的應(yīng)用。
[0141] 試驗(yàn)#2-細(xì)胞培養(yǎng)
[0142] 人惡性膠質(zhì)瘤U-87細(xì)胞和A-172細(xì)胞可獲自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收藏中心（ATCC)。夕卜 植體標(biāo)本（GBM-1)可采用標(biāo)準(zhǔn)的外科手術(shù)步驟從患有多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者體內(nèi)獲 得。細(xì)胞單層生長(zhǎng)在25cm 2的組織培養(yǎng)瓶中的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基 補(bǔ)充有0.2禮非必需氨基酸，10%胎牛血清，青霉素（1(^/1111)、鏈霉素（100 11111/1111)和兩性 霉素B (fungizone，2. 5mg/ml)。對(duì)于傳代培養(yǎng)物而已，細(xì)胞用磷酸緩沖鹽水（PBS, pH 7. 2) 清洗，通過(guò)短時(shí)間接觸胰蛋白酶分離并在培養(yǎng)基中懸浮。
[0143] 試驗(yàn)#3-細(xì)胞活力檢測(cè)
[0144] 在37°C，5% C02條件下，細(xì)胞（104/ml)于96孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時(shí)。然 后用DMEM或不同濃度的組合物（Sigma，St. Louis，M0,美國(guó)）處理培養(yǎng)物。48小時(shí)后，用 MTT(5mg/ml)處理細(xì)胞，黑暗中培養(yǎng)至少4小時(shí)，隨后將甲臜（formazan)結(jié)晶溶于200 y 1 DMS0中?？捎?30nm標(biāo)準(zhǔn)濾光片檢測(cè)570nm吸光度來(lái)定量MTT還原的增加部分。
[0145] 試驗(yàn)#4-細(xì)胞凋亡評(píng)價(jià)
[0146] 可通過(guò)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞周期分析來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡。就形態(tài)分析而言，細(xì)胞生長(zhǎng)在 25cm 2的燒瓶中，匯合之前用培養(yǎng)基或不同濃度的組合物處理，然后在接下來(lái)的48小時(shí)用光 學(xué)顯微鏡觀察。就細(xì)胞周期分析而言，細(xì)胞（2xl0 5/孔）接種于24孔組織培養(yǎng)板中，靜止 24小時(shí)，然后用培養(yǎng)基或不同濃度的活性劑處理并再培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞被收集、懸浮，并 在4°C黑暗條件下，在300 y 1/樣品的低滲熒光溶液（50 y g/ml碘化丙啶（PI)和0. 1%檸 檬酸鈉緩沖液中〇. 1% Triton X-100)中培養(yǎng)1小時(shí)。使用熒光激活的細(xì)胞分選掃描流式 細(xì)胞儀（FACSCalibur ;Becton_Dickinson，San Jose，CA)在 FL2H 通道中檢測(cè) DNA 含量。由 CellQuest軟件版本3. If控制數(shù)據(jù)的采集和分析。在'亞-G1-峰'包含亞二倍體DNA群的 的事件被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡。
[0147] 可以理解的是，盡管本發(fā)明已連同上述實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但是，以上描述和實(shí) 施例意在舉例說(shuō)明并不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明范圍內(nèi)的其他方面，優(yōu)勢(shì)以及修改對(duì)于 本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。下面列出了本發(fā)明的幾個(gè)方面。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于運(yùn)送治療劑的組合物，所述組合物包含： 治療劑； 約0? 015% (v/v)至約0? 04% (v/v)的紫蘇子醇或其類似物； 約1.3%的丙三醇卜八）；和 至少約1. 3%的乙醇，（v/v ;96%乙醇）， 其中，上述組分等于100% (v/v)的組合物， 其中，所述組合物通過(guò)吸入給藥、鼻內(nèi)給藥或眼部給藥中的一種或一種以上給藥方式 進(jìn)行給藥。
2. -種用于運(yùn)送治療劑的組合物，所述組合物包含： 治療劑； 約0.1% (v/v)至0.4% (v/v)的紫蘇子醇、紫蘇醛或紫蘇子醇的羧酸酯； 約1.3%的丙三醇卜八）；和 至少約1. 3%的乙醇，（v/v ;96%乙醇）， 其中，上述組分等于100% (v/v)的組合物， 其中，所述組合物通過(guò)吸入給藥、鼻內(nèi)給藥或眼部給藥中的一種或一種以上給藥方式 進(jìn)行給藥。
3. -種用于運(yùn)送治療劑的組合物，所述組合物包含： 治療劑； 約0.0001%至約0.01% (v/v)的紫蘇子醇、紫蘇醛或紫蘇子醇的羧酸酯； 約1.3%的丙三醇卜八）；和 至少約1. 3%的乙醇，（v/v ;96%乙醇）， 其中，上述組分等于100% (v/v)的組合物。
4. 一種用于運(yùn)送治療劑的組合物，所述組合物基本上由下列組分構(gòu)成： 治療劑； 約0.0001%至約0.01% (v/v)的紫蘇子醇、紫蘇醛或紫蘇子醇的羧酸酯； 約1.3%的丙三醇卜八）；和 至少約1. 3%的乙醇，（v/v ;96%乙醇）， 其中，上述組分等于100% (v/v)的組合物， 其中，所述組合物通過(guò)吸入給藥、鼻內(nèi)給藥或眼部給藥中的一種或一種以上給藥方式 進(jìn)行給藥。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的組合物，其中，所述紫蘇子醇、紫蘇醛或紫蘇子醇的羧酸酯 的量為約0.01%。
6. 如權(quán)利要求1、4或5所述的組合物，其中，所述組合物包含紫蘇子醇。
7. 如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述治療劑是抗癌藥物，其選自： DNA烷化劑（替莫唑胺，BCNU)、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑（即伊立替康）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑（即 塞來(lái)考昔、二甲基-塞來(lái)考昔）、硼放射致敏劑（即萬(wàn)珂）。
8. 如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述治療劑為化療劑或治療性抗
9. 如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述治療劑為替莫唑胺或二甲基塞 來(lái)考昔。
10. 如權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物被配制為用于兒科給藥的劑 型。
11. 權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的組合物在制備用于通過(guò)將藥物給藥于細(xì)胞、組織 或器官治療疾病的藥物中的應(yīng)用。
12. 如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其中，所述細(xì)胞為全身性癌癥細(xì)胞、原發(fā)性中樞神經(jīng)系 統(tǒng)（CNS)腫瘤細(xì)胞（膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤）、全身性癌癥的CNS轉(zhuǎn)移癌癥細(xì)胞、肺癌細(xì) 胞、前列腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、造血癌癥細(xì)胞、肺癌細(xì)胞或卵巢癌細(xì)胞中的一種或一種以 上。
13. 如權(quán)利要求11或12所述的應(yīng)用，其中，所述給藥在體外或體內(nèi)進(jìn)行。
14. 有效量的權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的組合物在制備用于通過(guò)將藥物給藥于人 類患者治療所述人類患者中的疾病的藥物中的應(yīng)用。
15. 如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中，所述疾病為全身性癌癥、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS)疾?。z質(zhì)瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤）、全身性癌癥的CNS轉(zhuǎn)移癌癥、肺癌、前列腺癌、乳 腺癌、造血癌癥或卵巢癌中的一種或一種以上。
16. 如權(quán)利要求11至15中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述藥物通過(guò)鼻內(nèi)給藥、吸入給藥 或眼部給藥中的一種或一種以上給藥方式給藥。
17. 權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的組合物在制備用于通過(guò)將藥物以吸入給藥、鼻內(nèi) 給藥或眼部給藥中的一種或一種以上給藥方式給藥于患者治療影響人類患者的中樞神經(jīng) 系統(tǒng)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
18. 如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中，所述疾病為原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)腫瘤或全 身性癌癥的CNS轉(zhuǎn)移。
19. 如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其中，所述全身性癌癥為肺癌、前列腺癌、乳腺癌、造血 癌癥或卵巢癌中的一種或一種以上。
20. -種試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的組合物、所述組合物 的給藥裝置以及使用說(shuō)明書(shū)。
21. -種用于確定治療劑是否為潛在的候選藥物的方法，所述方法包括使有效量的權(quán) 利要求1至10中任一項(xiàng)所述的組合物與第一細(xì)胞樣品在體外接觸，以及使一定量的所述治 療劑與第二細(xì)胞樣品接觸，從而，確定第一細(xì)胞樣品和第二細(xì)胞樣品的生長(zhǎng)是否受到抑制， 其中，如果所述第二樣品的生長(zhǎng)與第一樣品大體相同或大于第一樣品，則所述治療劑為用 于治療的潛在藥物。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述樣品包括全身性癌癥細(xì)胞、原發(fā)性中樞神經(jīng) 系統(tǒng)（CNS)腫瘤細(xì)胞（膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤）、全身性癌癥的CNS轉(zhuǎn)移癌癥細(xì)胞、肺癌 細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、造血癌癥細(xì)胞、肺癌細(xì)胞或卵巢癌細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明提供用于運(yùn)送治療劑的組合物。所述組合物包含治療劑和單萜或其類似物。一方面，所述單萜為紫蘇子醇(POH)或其類似物。另一方面，所述治療劑的量為有效治療所選擇的疾病或受治者的量。
【IPC分類】A61K31-4188, A61K31-045, A61K31-635, A61P35-00, A61K45-00, A61K31-11, A61K47-10
【公開(kāi)號(hào)】CN104523661
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410766939
【發(fā)明人】C·陳 托馬斯, O·達(dá)豐塞卡 克洛維斯, 奎里科·多斯桑托斯 特雷莎, 吉爾伯托·施瓦茨曼
【申請(qǐng)人】南加利福尼亞大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2010年2月4日
【公告號(hào)】CN102405044A, EP2393488A1, US8236862, US20100226913, US20120219541, WO2010091198A1