胃腸外諾如病毒疫苗配制劑的制作方法
【專利說明】胃腸外諾如病毒疫苗配制劑
[0001] 本申請是申請日為2012年07月11日、中國申請?zhí)枮?01280043691. 2、發(fā)明名稱 為"胃腸外諾如病毒疫苗配制劑"的發(fā)明申請的分案申請。
[0002] 對相關申請的交叉引用
[0003] 本申請要求2011年7月11日提交的美國臨時專利申請61/506,447的優(yōu)先權，其 全部內容通過提及并入本文。 發(fā)明領域
[0004] 本發(fā)明屬于疫苗，特別是諾如病毒疫苗領域。另外，本發(fā)明涉及制備疫苗組合物的 方法及誘導和評估人中針對諾如病毒的保護性免疫應答的方法。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 諾如病毒是不可培養(yǎng)的人類杯狀病毒，已經成為非細菌性胃腸炎的流行性爆發(fā)的 單一最重要起因（Glass等，2000;Hardy等，1999)。在靈敏的分子診斷測定法的開發(fā)之前， 對諾如病毒的臨床意義的重視不夠。原型基因小組I (genogroup I)諾沃克病毒（NV)基因 組的克隆和自重組桿狀病毒表達系統生成病毒樣顆粒（VLP)引起了測定法的開發(fā)，其揭示 了分布廣泛的諾如病毒感染（Jiang等1990 ; 1992)。
[0007] 諾如病毒是單鏈、正義RNA病毒，含有不分段的RNA基因組。病毒基因組編碼三個 可讀框，其中后兩個分別規(guī)定主要衣殼蛋白和次要結構蛋白的生成（Glass等2000)。當在 真核表達系統中以高水平表達時，NV和某些其它諾如病毒的衣殼蛋白自組裝成在結構上模 擬天然諾如病毒病毒體（virion)的VLP。當通過透射電子顯微術觀看時，VLP在形態(tài)上與 自人糞樣品分離的感染性病毒體不可區(qū)分。
[0008] 針對諾如病毒的免疫應答是復雜的，而且現在正在闡明保護的關聯（correlate)。 用天然病毒實施的人志愿者研究證明了粘膜衍生的記憶免疫應答提供免于感染的短期 保護并提示疫苗介導的保護是可行的（Lindesmith等2003 ;Parrino等1997 ;Wyatt 等，1974)。
[0009] 雖然由于VLP的可得性和它們被大量生成的能力，諾如病毒不能在體外培養(yǎng)，但 是在定義諾如病毒衣殼的抗原拓撲學和結構拓撲學方面已經取得了可觀的進步。VLP保 留病毒衣殼蛋白的真實構象（authentic confirmation)，但是缺乏感染性遺傳物質。結 果，VLP模擬病毒與細胞受體的功能相互作用，由此引發(fā)適宜的宿主免疫應答，但是缺乏繁 殖或引起感染的能力。與NIH聯合，貝勒醫(yī)學院（Baylor College of Medicine)在學術 性的、調查人發(fā)起的I期臨床試驗中研究了人志愿者中針對NV VLP的體液、粘膜和細胞免 疫應答?？诜┯肰LP在健康成人中是安全的且有免疫原性的（Ball等1999 Jacket等 2003)。但是，需要相對大量的多劑VLP以觀察免疫應答。在其它學術中心，在動物模型中 進行的臨床前實驗已經證明了當與細菌外毒素佐劑一起鼻內施用時針對VLP的免疫應答 的增強（Guerrero 等 2001 ;Nicollier_Jamot 等 2004 ;Periwal 等 2003 ;Souza 等（2007) Vaccine Vol. 25(50) :8448-59)。然而，人中針對諾如病毒的保護性免疫仍然難以捉摸， 因為人中保護性免疫應答的指標仍然尚未清楚鑒定（Herbst-Kralovetz等（2010)Expert Rev.Vaccines 9 (3)，299 - 307)。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明部分基于如下的發(fā)現，即單劑諾如病毒疫苗在胃腸外施用時在人中引發(fā)快 速的、強力的針對諾如病毒的保護性免疫應答。因而，本發(fā)明提供了一種在人中引發(fā)針對諾 如病毒的保護性免疫的方法，其包括對所述人胃腸外施用不超過單劑疫苗組合物，所述組 合物包含原型基因小組I和/或原型基因小組II諾如病毒VLP，其中與施用所述組合物前 所述人中的滴度相比，所述組合物至少誘導諾如病毒特異性血清抗體滴度的3倍升高。在 某些實施方案中，在施用所述單劑組合物的7天內誘導諾如病毒特異性抗體滴度的升高。 在一些實施方案中，經由靜脈內、皮下、皮內、或肌肉內施用路徑對所述人施用所述疫苗組 合物。在一個實施方案中，通過肌肉內施用路徑對所述人施用所述疫苗組合物。
[0012] 單劑疫苗組合物可以包含約5 ii g至約150 ii g劑量的原型基因小組I諾如病毒 VLP、原型基因小組II諾如病毒VLP、或這兩者。在單劑疫苗組合物包含原型基因小組I和原 型基因小組II諾如病毒VLP兩者的實施方案中，每種VLP的劑量可以是相同的或不同的。 在一個實施方案中，組合物包含不超過50 y g原型基因小組I諾如病毒VLP。在另一個實施 方案中，組合物包含不超過25 y g原型基因小組I諾如病毒VLP。在又一個實施方案中，組 合物包含不超過150 y g原型基因小組II諾如病毒VLP。在又一個實施方案中，組合物包含 不超過50 y g原型基因小組II諾如病毒VLP。諾如病毒VLP可以是單價VLP或多價VLP。
[0013] 在本發(fā)明的一些方面，疫苗組合物中的原型基因小組I諾如病毒VLP包含自原型 基因小組I病毒株衍生的衣殼蛋白。在一個實施方案中，原型基因小組I諾如病毒VLP包含 自原型基因小組I，基因型1諾如病毒衍生的衣殼蛋白。在另一個實施方案中，原型基因小 組I諾如病毒VLP包含來自諾沃克病毒的衣殼蛋白。在本發(fā)明的其它方面，疫苗組合物中 的原型基因小組II諾如病毒VLP包含自原型基因小組II病毒株衍生的衣殼蛋白。在一些 實施方案中，原型基因小組II諾如病毒VLP包含來自原型基因小組II，基因型4諾如病毒 的衣殼蛋白。在某些實施方案中，原型基因小組II諾如病毒VLP是自表達原型基因小組II 諾如病毒共有序列生成的VLP。在一個具體的實施方案中，原型基因小組II諾如病毒VLP 包含具有序列SEQ ID NO: 1的衣殼蛋白。
[0014] 在某些實施方案中，疫苗組合物進一步包含至少一種佐劑。優(yōu)選地，佐劑不是細菌 外毒素佐劑。在一個實施方案中，佐劑是toll樣受體激動劑，諸如單磷酰脂質A(MPL)、鞭毛 蛋白、或CpG。在另一個實施方案中，佐劑是氫氧化鋁（例如明礬）。在某些實施方案中，疫 苗組合物包含兩種佐劑，諸如MPL和氫氧化鋁。在一些實施方案中，疫苗組合物可以進一步 包含緩沖劑，諸如L-組氨酸、咪唑、琥珀酸、Tris、和檸檬酸。疫苗組合物可以配制為干粉末 或液體。在一個實施方案中，疫苗組合物配制為液體（例如水性配制劑）。
[0015] 本申請涉及下述各項實施方案。
[0016] 1.一種在人中引發(fā)針對諾如病毒（Norovirus)的保護性免疫的方法，其包括對所 述人胃腸外施用不超過單劑疫苗組合物，所述組合物包含原型基因小組I諾如病毒病毒樣 顆粒（VLP)，其中與施用所述組合物前所述人中的滴度相比，所述組合物至少誘導諾如病毒 特異性血清抗體滴度的3倍升高，且其中所述原型基因小組I諾如病毒VLP包含自原型基 因小組I病毒株衍生的衣殼蛋白。
[0017] 2.實施方案1的方法，其中所述組合物包含不超過150 iig所述原型基因小組I諾 如病毒VLP。
[0018] 3.實施方案1的方法，其中所述組合物包含不超過50 ii g所述原型基因小組I諾 如病毒VLP。
[0019] 4.實施方案1的方法，其中所述組合物包含不超過25 ii g所述原型基因小組I諾 如病毒VLP。
[0020] 5.實施方案1的方法，其中所述組合物包含不超過15 ii g所述原型基因小組I諾 如病毒VLP。
[0021] 6.實施方案1的方法，其中與施用所述組合物前所述人中的滴度相比，所述組合 物至少誘導諾如病毒特異性血清抗體滴度的6倍升高。
[0022] 7.實施方案1的方法，其中所述諾如病毒VLP是單價VLP或多價VLP。
[0023] 8.實施方案1的方法，其中所述組合物進一步包含原型基因小組II諾如病毒 VLP，所述原型基因小組II諾如病毒VLP包含自原型基因小組II病毒株衍生的衣殼蛋白。
[0024] 9.實施方案8的方法，其中所述組合物包含不超過150 y g原型基因小組II諾如 病毒VLP。
[0025] 10.實施方案8的方法，其中所述組合物包含不超過50 y g原型基因小組II諾如 病毒VLP。
[0026] 11.實施方案8的方法，其中所述組合物包含不超過25 y g原型基因小組II諾如 病毒VLP。
[0027] 12.實施方案8的方法，其中所述組合物包含不超過15 y g原型基因小組II諾如 病毒VLP。
[0028] 13.實施方案8的方法，其中所述原型基因小組I諾如病毒VLP是諾沃克 (Norwalk)病毒VLP，且所述原型基因小組II諾如病毒VLP是自表達原型基因小組II諾如 病毒的共有序列生成的VLP。
[0029] 14. -種在人中引發(fā)針對諾如病毒的保護性免疫的方法，其包括對所述人胃腸 外施用不超過單劑疫苗組合物，所述組合物包含原型基因小組II諾如病毒病毒樣顆粒 (VLP)，其中與施用所述組合物前所述人中的滴度相比，所述組合物至少誘導諾如病毒特異 性血清抗體滴度的3倍升高，且其中所述原型基因小組II諾如病毒VLP包含自原型基因小 組II病毒株衍生的衣殼蛋白。
[0030] 15.實施方案14的方法，其中所述組合物包含不超過150 iig所述原型基因小組 II諾如病毒VLP。
[0031] 16.實施方案14的方法，其中所述組合物包含不超過50 ii g所述原型基因小組II 諾如病毒VLP。
[0032] 17.實施方案14的方法，其中所述組合物包含不超過25 y g所述原型基因小組II 諾如病毒VLP。
[0033] 18.實施方案14的方法，其中所述組合物包含不超過15 y g所述原型基因小組II 諾如病毒VLP。
[0034] 19.實施方案14的方法，其中所述原型基因小組II諾如病毒VLP包含自原型基因 小組II，基因型4病毒株衍生的衣殼蛋白。
[0035] 20.實施方案14的方法，其中與施用所述組合物前所述人中的滴度相比，所述組 合物至少誘導諾如病毒特異性血清抗體滴度的6倍升高。
[0036] 21.實施方案14的方法，其中所述諾如病毒VLP是單價VLP或多價VLP。
[0037] 22.實施方案14的方法，其中所述組合物進一步包含原型基因小組I諾如病毒 VLP，所述原型基因小組I諾如病毒VLP包含自原型基因小組I病毒株衍生的衣殼蛋白。
[0038] 23.實施方案22的方法，其中所述組合物包含不超過150 y g原型基因小組I諾如 病毒VLP。
[0039] 24.實施方案22的方法，其中所述組合物包含不超過50 y g原型基因小組I諾如 病毒VLP。
[0040] 25.實施方案22的方法，其中所述組合物包含不超過25 y g原型基因小組I諾如 病毒VLP。
[0041] 26.實施方案22的方法，其中所述組合物包含不超過15 ii g原型基因小組I諾如 病毒VLP。
[0042] 27.實施方案14的方法，其中所述原型基因小組II諾如病毒VLP是自表達原型基 因小組II諾如病毒的共有序列生成的VLP。
[0043] 28.實施方案1至27中任一項的方法，其中所述組合物進一步包含至少一種佐劑。
[0044] 29.實施方案28的方法，其中所述至少一種佐劑是Toll樣受體激動劑。
[0045] 30.實施方案1至27中任一項的方法，其中所述組合物進一步包含兩種佐劑。
[0046] 31.實施方案30的方法，其中所述兩種佐劑是單磷酰脂質A和氫氧化鋁。
[0047] 32.實施方案1至31中任一項的方法，其中所述組合物進一步包含緩沖劑。
[0048] 33.實施方案32的方法，其中所述緩沖劑選自下組：L_組氨酸、咪唑、琥珀酸、 Tris、和梓檬酸。
[0049] 34.實施方案1至33中任一項的方法，其中通過靜脈內、皮下、皮內、或肌肉內施用 路徑對所述人施用所述疫苗組合物。
[0050] 35.實施方案34的方法，其中通過肌肉內施用路徑對所述人施用所述疫苗組合 物。
[0051] 36.實施方案1至35中任一項的方法，其中所述疫苗組合物配制為液體。
[0052] 37.實施方案1至35中任一項的方法，其中在施用所述單劑組合物的7天內誘導 諾如病毒特異性抗體滴度的升高。
[0053] 38.實施方案1至35中任一項的方法，其中所述疫苗組合物賦予保護免于諾如病 毒感染的一種或多種癥狀。
[0054] 附圖簡述
[0055] 圖1 :泛ELISA測定法的結果，所述泛ELISA測定法測量來自用安慰劑（鹽水）或 含有5,15,50,或150 y g原型基因小組I. 1諾如病毒VLP和原型基因小組II. 4諾如病毒 VLP之每種的疫苗配制劑肌肉內免疫的人志愿者的組合血清IgG，IgA，和IgM水平。在第 一次免疫后7和21天時及第二次免疫后7和28天時對每個劑量水平顯示抗GI. I (A)和抗 GII. 4(B)抗體的幾何均值滴度。志愿者在研究第0天和第28天接受免疫。
[0056] 圖2 :泛ELISA測定法的結果，所述泛ELISA測定法測量來自用安慰劑（鹽水）或 含有5,15,50,或150 y g原型基因小組I. 1諾如病毒VLP和原型基因小組II. 4諾如病毒 VLP之每種的疫苗配制劑肌肉內免疫的人志愿者的組合的血清IgG，IgA，和IgM水平。在第 一次免疫后7和21天時及第二次免疫后7和28天時對每個劑量水平顯示抗GI. I (A)和抗 GII. 4(B)抗體的幾何均值倍數升高。志愿者在研究第O天和第28天接受免疫。
[0057] 圖3 :泛ELISA測定法的結果，所述泛ELISA測定法測量來自用安慰劑（鹽水）或 含有5,15,50,或150 y g原型基因小組I. 1諾如病毒VLP和原型基因小組II. 4諾如病毒 VLP之每種的疫苗配制劑肌肉內免疫的人志愿者的組合的血清IgG，IgA，和IgM水平。在第 一次免疫后7和21天時及第二次免疫后7和28天時對每個劑量水平顯示抗GI. I (A)和抗 GII. 4(B)抗體的百分比血清響應率（即，與免疫前滴度相比抗體滴度的4倍升高）。志愿 者在研究第〇天和第28天接受免疫。
[0058] 圖4 :ELISA測定法的結果，所述ELISA測定法測量來自用安慰劑（鹽水）或含有 5.15, 或50 y g原型基因小組I. 1諾如病毒VLP和原型基因小組II. 4諾如病毒VLP之每種 的疫苗配制劑肌肉內免疫的人志愿者的血清IgA。在第一次免疫后7和21天時及第二次免 疫后7和28天時對每個劑量水平顯示抗GI. I (A)和抗GII. 4 (B)抗體的幾何均值滴度。志 愿者在研究第〇天和第28天接受免疫。
[0059] 圖5 :ELISA測定法的結果，所述ELISA測定法測量來自用安慰劑（鹽水）或含有 5.15, 或50 y g原型基因小組I. 1諾如病毒VLP和原型基因小組II. 4諾如病毒VLP之每種 的疫苗配制劑肌肉內免疫的人志愿者的血清IgA。在第一次免疫后7和21天時及第二次 免疫后7和28天時對每個劑量水平顯示抗GI. I (A)和抗GII. 4 (B)抗體的幾何均值倍數增 加。志愿者在研究第0天和第28天接受免疫。
[0060] 圖6 :ELISA測定法的結果，所述ELISA測定法測量來自用安慰劑（鹽水）或含有 5.15, 或50 y g原型基因小組I. 1諾如病毒VLP和原型基因小組II. 4諾如病毒VLP之每種 的疫苗配制劑肌肉內免疫的人志愿者的血清IgA。在第一次免疫后7和21天時及第二次免 疫后7和28天時對每個劑量水平顯示抗GI. I (A)和抗GII. 4 (B)抗體的百分比血清響應率 (即，與免疫前滴度相比抗體滴度的4倍升高）。志愿者在研究第0天和第28天接受免疫。 志愿者在研究第0天和第28天接受免疫。
[0061] 圖7 :ELISA測定法的結果，所述ELISA測定法測量來自用安慰劑（鹽水）或含有 5.15, 或50 y g原型基因小組I. 1諾如病毒VLP和原型基因小組II. 4諾如病毒VLP之每種 的疫苗配制劑肌肉內免疫的人志愿者的血清IgG。在第一次免疫后7和21天時及第二次免 疫后7和28天時對每個劑量水平顯示抗GI. I (A)和抗GII. 4 (B)抗體的幾何均值滴度。志 愿者在研究第〇天和第28天接受免疫。
[0062] 圖8 :ELISA測定法的結果，所述ELISA測定法測量來自用安慰劑（鹽水）或含有 5.15, 或50 y g原型基因小組I. 1諾如病毒VLP和原型基因小組II. 4諾如病毒VLP之每種 的疫苗配制劑肌肉內免疫的人志愿者的血清IgG。在第一次免疫后7和21天時及第二次 免疫后7和28天時對每個劑量水平顯示抗GI. I (A)和抗GII. 4 (B)抗體的幾何均值倍數增 加。志愿者在研究第0天和第28天接受免疫。
[0063] 圖9 :ELISA測定法的結果，所述ELISA測定法測量來自用安慰劑（鹽水）或含有 5.15, 或50 y g原型基因小組I. 1諾如病毒VLP和原型基因小組II. 4諾如病毒VLP之每種 的疫苗配制劑肌肉內免疫的人志愿者的血清IgG。在第一次免疫后7和21天時及第二次免 疫后7和28天時對每個劑量水平顯示抗GI. I (A)和抗GII. 4 (B)抗體的百分比血清響應率 (即，與免疫前滴度相比抗體滴度的4倍升高）。志愿者在研究第0天和第28天接受免疫。 志愿者在研究第O天和第28天接受免疫。
[0064] 圖10:泛ELISA測定法的結果，所述泛ELISA測定法測量來自在指定的時間點時 用如 El Kamary 等（2010)J Infect Dis, Vol. 202(11):1649-1658 中描述的鼻內單價諾如 病毒疫苗（LV01-103組）或如實施例1中描述的肌肉內二價諾如病毒疫苗（LV03-104組） 免疫的人志愿者的組合的血清IgG，IgA，和IgM水平。人志愿者接受安慰劑或兩劑肌肉內 或鼻內疫苗配制劑。肌肉內二價諾如病毒疫苗含有5yg原型基因小組I. 1諾如病毒VLP 和原型基因小組II. 4諾如病毒VLP之每種。鼻內單價疫苗含有10