稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量， 搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；
[0078] (3)混合對(duì)照品溶液的制備：精密稱取人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1，三七皂苷札對(duì) 照品和人參皂苷Re適量，加甲醇制成每ImL含人參皂苷Rg 1O. 4mg，人參皂苷Rb1O. 4mg，人參 皂苷ReO. lmg，三七皂苷R1O. Img的混合溶液，即得；
[0079] (4)測定：分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 y L進(jìn)樣，測定。
[0080] 所述的藥物組合物可用于制備提高免疫力、抗腫瘤、治療高血壓、治療心血管病、 治療腦血管病、治療糖尿病、治療高血脂、治療代謝綜合征、治療乳腺增生、治療抑郁癥、抗 衰老、美容養(yǎng)顏的藥物或保健品中的應(yīng)用。
[0081] 實(shí)驗(yàn)一：本發(fā)明藥物增強(qiáng)免疫力實(shí)驗(yàn)研究
[0082] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0083] I. 1受試物
[0084] 本發(fā)明藥物：參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例1制備。
[0085] 對(duì)比藥物A :參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例2制備。
[0086] 對(duì)比藥物B :參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例3制備。
[0087] 對(duì)比藥物C :參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例4制備。
[0088] 1. 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)清潔級(jí)昆明種雄性小鼠150只，體質(zhì)量18~21g，由南京中醫(yī) 藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在溫度18~24°C、濕度40%~70%的環(huán)境中飼養(yǎng)。
[0089]1. 3主要試劑綿羊紅細(xì)胞（SRBC)，HanK液（pH值7. 2~7. 4)，RPMI1640培養(yǎng)液。 小牛血清，青鏈霉素，刀豆蛋白A(ConA)，MTT，補(bǔ)體（豚鼠血清），SA緩沖液，印度墨汁，都氏 試劑，YAC-I細(xì)胞等。
[0090] I. 4主要儀器潔凈工作臺(tái)，二氧化碳（CO2)培養(yǎng)箱，離心機(jī)，TU-1901雙光束紫外 可見光分光光度計(jì)（北京普析），酶標(biāo)儀，顯微鏡，游標(biāo)卡尺等。
[0091] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0092] 2. 1動(dòng)物分組及給藥方法參照文獻(xiàn)（1.中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品功能學(xué) 評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法[S]. 2003. ;2.徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 3版.北 京：人民衛(wèi)生出版社，2002:1420-1460)。實(shí)驗(yàn)分3大組，每大組60只小鼠。免疫1組測定 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH)和抗體生成細(xì)胞數(shù)；免疫2組進(jìn)行ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí) 驗(yàn)、NK細(xì)胞活性測定；免疫3組進(jìn)行碳廓清實(shí)驗(yàn)。每大組60只小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、 陽性對(duì)照組及本發(fā)明藥物組、對(duì)比藥物A組、對(duì)比藥物B組、對(duì)比藥物C組，每組10只。陰 性對(duì)照組給予純化水，陽性對(duì)照組給予配制成15. Omg ^mL 1靈芝全粉溶液，本發(fā)明藥物組給 予配制成66. Omg ? mL 1本發(fā)明藥物溶液、對(duì)比藥物A組給予配制成66. Omg ? mL 1對(duì)比藥物 A溶液、對(duì)比藥物B組給予配制成66. Omg ? mL 1對(duì)比藥物B溶液、對(duì)比藥物C組給予配制成 66. Omg ? mL 1對(duì)比藥物C溶液。各組灌胃體積均為20mL ? kg \ qd，連續(xù)灌胃15d。
[0093] 2. 2細(xì)胞免疫功能測定檢測給藥后各組小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH)的情況，采用 足跖增厚法。每鼠腹腔注射2% (V/V) SRBC懸液0.2mL。致敏后4d，測量左后足跖厚度。在 測量部位皮下注射20% SRBC。每鼠20 y L，24h后測量左后足跖腫脹厚度，連續(xù)測3次，取 均值。以前后足跖厚度差值表示DTH程度。
[0094] ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，采用MTT法檢測小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及增殖情 況。無菌取脾，于無菌HanK液中制成細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，HanK液洗3次。用RPmL1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3 X 106個(gè)? mL i。而后分兩孔加入24孔培養(yǎng)板，每孔1.0 mL，一孔 加ConA液50 y L，一孔作對(duì)照，置5% C02、37°C培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔吸去上清液 0. 7mL，加入不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液和MTT (5mg .mL \每孔50 y L)。培養(yǎng)結(jié)束后， 每孔加入酸性異丙醇lmL，吹打混勻，波長570nm處用酶標(biāo)儀測定吸光度值（A值）。淋巴細(xì) 胞的增殖能力用加ConA孔的A值減不加ConA孔的A值表示。
[0095] 2. 3體液免疫功能測定以抗體生成細(xì)胞檢測測定藥物對(duì)小鼠體液免疫功能的影 響，采用Jeme改良玻片法。每鼠腹腔注射2 % SRBC懸液0. 2mL，免疫后4d，處死小鼠，取脾， 用HanK液制成細(xì)胞懸液，篩孔內(nèi)徑（75. 0±4. I) ym(200目）篩網(wǎng)過濾，洗滌、離心2次， 最后將細(xì)胞懸浮在HanK液5mL中。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后與等量pH值7. 4、2倍濃度 的HanK液混合，分裝小試管，每管0. 5mL。再向管內(nèi)加入用HanK液配制的10% SRBC懸液 50 y L、脾細(xì)胞懸液20 y L，迅速混勻后傾倒于已刷薄層瓊脂糖的玻片上，凝固后，放入二氧 化碳培養(yǎng)箱中溫育I. 5h，加HanK液稀釋的補(bǔ)體（1 :10)，繼續(xù)溫育I. 5h后計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。
[0096] 2. 4單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能測定采用小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)檢測小鼠單核-巨噬細(xì) 胞吞噬功能。小鼠尾靜脈注射IOmL ? kg 1以0. 9%氯化鈉溶液稀釋4倍的印度墨汁，立即 計(jì)時(shí)，注入墨汁后第2,10分鐘，從內(nèi)眥靜脈叢取血20 y L，加到0. 1 %碳酸鈉溶液2mL中，搖 勻，600nm波長處測A值。處死小鼠，取肝、脾稱重，按下式計(jì)算吞噬指數(shù)：吞噬指數(shù)（a)= K 1/3X體重八肝重+脾重）。式中K= (IgA1-IgA2) Atft1)。A#2min時(shí)吸光度，A 2為 IOmin時(shí)吸光度，!:山分別為2, IOmin。
[0097] 2. 5NK細(xì)胞活性測定采用乳酸脫氫酶（LDH)測定法檢測NK細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)前24h 將YAC-I細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4 X IO5個(gè)? mL 1。動(dòng) 物給完藥后無菌取脾，置于盛有適量無菌HanK液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成 單細(xì)胞懸液。經(jīng)篩孔內(nèi)徑（75.0±4. I) ym(200目）篩網(wǎng)過濾，加入0. 5mL滅菌水20s裂解 紅細(xì)胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X IO7個(gè)? mL 1。取YAC-I細(xì)胞和脾細(xì)胞 各100 y L，加入96孔培養(yǎng)板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 y L，靶細(xì)胞最 大釋放孔加靶細(xì)胞和2. 5% Triton各100 y L ;上述各項(xiàng)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37°C、5% 0)2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500r ? min 1離心5min，每孔吸取上清液100 y L置 平底96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液IOOy L，反應(yīng)3min，每孔加入Imol ? L 1鹽酸溶 液30 y L，在酶標(biāo)儀490nm處測定A值。NK細(xì)胞活性（％ )=(反應(yīng)A值-自然釋放孔A 值）八最大釋放孔4值-自然釋放孔4值）乂100%。
[0098] 2. 6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用Excel、SPSS10. 0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化和統(tǒng)計(jì)分析。方差齊性檢 驗(yàn)合格后，采用dunnet單因素多重比較統(tǒng)計(jì)分析。
[0099] 3 結(jié)果
[0100] 3. 1本發(fā)明藥物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能實(shí)驗(yàn)在小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明 藥物組及陽性對(duì)照組足跖增厚值與陰性對(duì)照組比較，差異有極顯著性。表明本發(fā)明藥物液 能增加小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明藥物組及陽 性對(duì)照組A值差值高于陰性對(duì)照組，差異有顯著性。表明本發(fā)明藥物能提高小鼠脾淋巴細(xì) 胞轉(zhuǎn)化的能力。結(jié)果見表1-1。
[0101] 3. 2對(duì)小鼠體液免疫功能的影響對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞的影響見表1。本發(fā)明藥物 組及陽性對(duì)照組小鼠溶血空斑數(shù)均高于陰性對(duì)照組，對(duì)比藥物A組、對(duì)比藥物B組、對(duì)比藥 物C組對(duì)小鼠體液免疫功能的影響不明顯。表明本發(fā)明藥物能夠提高小鼠的抗體生成細(xì)胞 數(shù)，提示本發(fā)明藥物具有增強(qiáng)小鼠體液免疫的功能。
[0102] 表1-1各組小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和抗體生成細(xì)胞數(shù)結(jié)果士 s):
[0103]
[0104] 注：與陰性對(duì)照組比較，*P〈0. 01，#P〈0. 05
[0105] 3. 3本發(fā)明藥物對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響經(jīng)方差分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)兩 兩比較，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明藥物組及陽性對(duì)照組小鼠的碳廓清吞噬指數(shù)A均高于陰性對(duì)照組，差 異有極顯著性（P〈〇. 01)，表明本發(fā)明藥物具有增強(qiáng)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用， 對(duì)比藥物A組、對(duì)比藥物B組、對(duì)比藥物C組作用不明顯，見表1-2。
[0106] 3. 4本發(fā)明藥物對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響經(jīng)方差分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)兩兩比較，發(fā)現(xiàn) 本發(fā)明藥物組及陽性對(duì)照組小鼠的NK細(xì)胞活性均高于陰性對(duì)照組，差異有顯著性。表明本 發(fā)明藥物各劑量具有增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞活性的作用。結(jié)果見表1-2。
[0107] 表1-2各組小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清和NK細(xì)胞活性的檢測結(jié)果（i±s)
[0110] 注：與陰性對(duì)照組比較，*P〈0. 01，#P〈0. 05
[0111] 4討論與結(jié)論
[0112] 本發(fā)明藥物能增加小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，可增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn) 化增殖能力，有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能作用；提高小鼠的抗體生成細(xì)胞數(shù)，有增強(qiáng)體液免疫功能 作用；有增強(qiáng)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能及增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞活性的作用。表明本發(fā)明藥 物具有增強(qiáng)小鼠細(xì)胞和體液免疫功能及非特異性的作用。
[0113] 實(shí)驗(yàn)二：本發(fā)明藥物抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究
[0114] 1 材料
[0115] 本發(fā)明藥物：參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例1制備。
[0116] 對(duì)比藥物A :參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例2制備。
[0117] 對(duì)比藥物B :參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例3制備。
[0118] 對(duì)比藥物C :參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例4制備。
[0119] 注射用環(huán)磷酰胺，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20023036 ;
[0120] 健康昆明種小鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量18~22g;小鼠肝癌H22細(xì)胞株購于南京中醫(yī) 藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，肉瘤S18。細(xì)胞株，購于由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。
[0121] 2 方法
[0122] 2. 1制備瘤細(xì)胞懸液在無菌操作下取瘤塊，稱重，用玻璃組織勻漿器研磨，磨勻后 放入無菌容器內(nèi)，加生理鹽水稀釋成1 :3的細(xì)胞懸液，容器置冰塊上，充分混勻。
[0123] 2. 2本發(fā)明藥物對(duì)H22移植性實(shí)體瘤的抑制作用取小鼠60只，每只小鼠均于右前 腋下接種H22瘤細(xì)胞液0. 2ml。次日稱體質(zhì)量，并隨機(jī)分為6組，即生理鹽水組、環(huán)磷酰胺組、 本發(fā)明藥物組、對(duì)比藥物A組、對(duì)比藥物B組、對(duì)比藥物C組，每組10只小鼠。接種24h后 灌胃給藥，灌胃體積為20ml/kg體質(zhì)量，1次/d，連續(xù)給藥10d，環(huán)磷酰胺組腹腔注射給藥，隔 日1次。停藥后次日處死小鼠稱重，并小心剝離瘤組織、胸腺及脾臟，分別稱重，并計(jì)算抑瘤 率、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)。
[0124] 2. 4本發(fā)明藥物對(duì)S180腹水瘤小鼠存活期的影響取小鼠50只，每只小鼠均腹腔 接種S180瘤細(xì)胞液0. 2ml。隨機(jī)分為5組，即生理鹽水組、本發(fā)明藥物組、對(duì)比藥物A組、對(duì) 比藥物B組、對(duì)比藥物C組，，每組10只小鼠。接種24h后灌胃給藥，灌胃體積為20ml/kg 體質(zhì)量，1次/d，連續(xù)給藥10d。以接種腫瘤之日算起，記錄死亡時(shí)間，計(jì)算生命延長率。
[0125] 2. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差G士s)表示，采用F檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析。
[0126] 3 結(jié)果
[0127] 3. 1對(duì)H22移植性實(shí)體瘤的抑制作用本發(fā)明藥物對(duì)H22移植性實(shí)體瘤的抑制與生 理鹽水組相比，本發(fā)明藥物有顯著抑制H 22移植性實(shí)體瘤生長的作用（P〈0. 01)，并且本發(fā)明 藥物對(duì)小鼠體質(zhì)量的增加沒有明顯的抑制作用。環(huán)磷酰胺雖然抑瘤效果最好，抑瘤率達(dá)到 68. 71%，但是其對(duì)小鼠的增長有明顯的抑制作用。見表2-1。
[0128] 表2-1本發(fā)明藥物對(duì)H22移植性實(shí)體瘤的抑制作用（10例）
[0130] 注：與生理鹽水組比較，#P〈0. 01
[0131] 3. 2對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響見表2-2。
[0132] 表2-2本發(fā)明藥物對(duì)荷瘤（H22)鼠免疫器官的影響（.[士10例）
[0138] 注：與生理鹽水組比較，#P〈0. 01
[0139] 4討論與結(jié)論
[0140] 在腫瘤的臨床治療中，主要應(yīng)用的仍然是傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類化療藥物。該類藥物在 發(fā)揮療效的同時(shí)，對(duì)機(jī)體的毒副作用明顯，尤其是對(duì)免疫力有較大的破壞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步說 明增強(qiáng)免疫功能是本發(fā)明藥物抗腫瘤的可能途徑之一。本發(fā)明藥物除了增強(qiáng)機(jī)體免疫功能 之外，尚有抗氧化、提高機(jī)體應(yīng)激能力等多種活性。
[0141] 實(shí)驗(yàn)三：本發(fā)明藥物對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響
[0142] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0143] I. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0144] 成年雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR) 40只，體重225±30g。Wistar大鼠10只，雌雄 兼用，鼠齡12周，體重245g~310g。
[0145] 1.2實(shí)驗(yàn)藥品
[0146] 本發(fā)明藥物：參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例1制備。
[0147] 對(duì)比藥物A :參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例2制備。
[0148] 對(duì)比藥物B :參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例3制備。
[0149] 對(duì)比藥物C :參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例4制備。
[0150] 陽性中藥：山菊降壓片，河北恒利集團(tuán)制藥股份有限公司生產(chǎn)，將中藥配成濃度為 0? 0288g/ml。按lml/100g的體積灌胃給藥。
[0151] L 3實(shí)驗(yàn)儀器
[0152] 清醒大鼠血壓心率測定儀，HX-III型
[0153] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0154] 2. 1 分組
[0155] 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成7組，每組10只，分組情況如下：
[0156] (1)空白對(duì)照組，Wistar大鼠；（2)模型對(duì)照組，SHR模型對(duì)照；（3)陽性對(duì)照組， 服用山菊降壓片；(4)本發(fā)明藥物組，服用本發(fā)明藥物；（5)對(duì)比藥物A組，服用對(duì)比藥物A ; (6)對(duì)比藥物B組，服用對(duì)比藥物B ; (7)對(duì)比藥物C組，服用對(duì)比藥物C ;
[0157] 2. 2 給藥
[0158] 正式實(shí)驗(yàn)前每天測壓訓(xùn)練1次，連續(xù)7天，待大鼠適應(yīng)環(huán)境、血壓穩(wěn)定后將SHR隨 機(jī)分為7組，每組10只，即空白對(duì)照組、SHR模型對(duì)照組、山菊降壓片陽性對(duì)照組、本發(fā)明藥 物組、對(duì)比藥物A組，對(duì)比藥物B組、對(duì)比藥物C組，分別灌胃給藥，山菊降壓片陽性對(duì)照組、 本發(fā)明藥物組、對(duì)比藥物A，對(duì)比藥物B、對(duì)比藥物C，空白組、模型對(duì)照組給予相同體積的蒸 餾水。給藥時(shí)間為每天上午。連續(xù)給藥28天，于第29天測定給藥后的血壓。
[0159] 2. 3實(shí)驗(yàn)步驟
[0160] 測壓前將SHR放入37 ± I °C電熱恒溫箱內(nèi)，加溫使鼠尾動(dòng)脈充分?jǐn)U張，用清醒大鼠 血壓心率測定儀間接測大鼠尾動(dòng)脈的收縮壓，取連續(xù)3次血壓值不超過5mmHg差異的平均 值作為應(yīng)測血壓值，采用自身前后及組間F檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，比較給藥前后及組間血壓 均數(shù)差異的顯著性。
[0161] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0162] 見表 3-1 和表 3-2。
[0163] 表3-1療程給藥后測SBP (mmHg)
[0164]
[0169] 注：與模型對(duì)照組比較，A P < 0. 05 ;與陽性對(duì)照組比較，*P < 0. 05 ;與本發(fā)明藥 物比較，#P < 0. 05。
[0170] 由表3-U3-2可知，模型組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間血壓與治療前相比無明顯差異（P > 0. 05)。連續(xù)灌服本發(fā)明藥物組血壓緩慢下降，28天后SBP、DBP分別平均下降值為 70. 02±15. 56mmHg、53. 90±14. 34mmHg，與模型組相比有明顯差異（A P < 0. 05 )，與 陽性對(duì)照組相比也有明顯差異（*P< 0.05 );給予山菊降壓片血壓也明顯下降，28天后 SBP、DBP分別平均下降值為62. 22±16. 54mmHg、45. 04±15. 82mmHg，明顯優(yōu)于模型組（A P < 0? 05) 〇
[0171] 以上結(jié)果表明，本發(fā)明藥物具有明顯的降壓效果，其降壓作用較持久，且明顯優(yōu)于 對(duì)比藥物A組，對(duì)比藥物B組、對(duì)比藥物C組，也明顯優(yōu)于陽性對(duì)照藥山菊降壓片。
[0172] 實(shí)驗(yàn)四：本發(fā)明藥物降血脂作用的實(shí)驗(yàn)研究
[0173] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0174] I. 1 藥物
[0175] 本發(fā)明藥物：參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例1制備。
[0176] 對(duì)比藥物A :參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例2制備。
[0177] 對(duì)比藥物B :參照本發(fā)明說明書【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例3制備。
[0178] 對(duì)比藥物C