議上給出并且在表2中給出對(duì)6B、19F、 19A和6A疾病的發(fā)現(xiàn)總結(jié)。這些數(shù)據(jù)表明Prevnar能夠預(yù)防由于6A引起的疾病，盡管其預(yù) 防水平比預(yù)防血清型6B型引起的疾病低一些。這些數(shù)據(jù)還表明對(duì)由于19A引起的侵入性 疾病的交叉保護(hù)是有限的。
[0052] 表2?⑶C進(jìn)行的病例對(duì)照試驗(yàn)的初步結(jié)果（在2003年ICAAC上給出）
[0053]
[0054] *比較接種的（多1劑）對(duì)比未接種的疫苗有效性，并根據(jù)潛在的條件調(diào)節(jié)
[0055] 參考文獻(xiàn)40和個(gè)人/私密交流
[0056] Prevnar使用的經(jīng)公布的分析[3]也表明在2歲以下兒童中血清型6B和19F型使 得血清型6A和19A型引起的Iro適度減少（[3]中的表1)。在血清型6A、9A、9L、9N、18A、 18B、18F、19A、19B、19C、23A和23B型（"都是疫苗相關(guān)的血清型"）引起的未免疫成年人中的 疾病發(fā)生率有一定的降低（[3]中的表2)。這些數(shù)據(jù)確定來(lái)自2歲以下兒童中使用Prevnar 的群體免疫對(duì)于血清型6A和19A型是中等的，并且提供了在本發(fā)明的13vPnC疫苗中包括 血清型6A和19A型的基拙。
[0057] 加入6A和19A型的結(jié)論
[0058] 在圖1和表2中使用7vPnC疫苗的上市后監(jiān)視數(shù)據(jù)和病例-對(duì)照研究結(jié)果表明， 與上述在動(dòng)物模型中關(guān)于免疫應(yīng)答和性能的其他信息相一致，可能存在對(duì)6A型疾病的一 定的交叉保護(hù)，但是比對(duì)6B型疾病的交叉保護(hù)程度較低。此外，似乎對(duì)19A型的保護(hù)是有 限的。因此，含有血清型6A和19A型的13vPnC疫苗提供了覆蓋，其不依賴于通過(guò)血清型6B 和19F型的血清群交叉保護(hù)的局限性。
[0059] 因此，本發(fā)明提供了包含13種不同的多糖-蛋白質(zhì)綴合物以及生理學(xué)上可接受 載體的多價(jià)免疫原性組合物，其中每種綴合物含有綴合到載體蛋白的不同的莢膜多糖綴合 物，并且其中從肺炎鏈球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型制備 莢膜多糖。一種此類載體蛋白是稱作CRM197的白喉毒素。免疫原性組合物可以還包含佐劑， 如鋁類佐劑，如磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁。
[0060] 通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備莢膜多糖。在本發(fā)明中，從肺炎鏈球菌 的血清型1、3、4、5、6六、68、7?、利、14、18(：、194、19?和23?型制備莢膜多糖。通過(guò)單獨(dú)的方法 制備這些肺炎球菌綴合物并配制成單劑量制劑。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，在基于大豆的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)每種肺炎球菌多糖血清型。然后通過(guò)離心、沉淀、超濾和柱層析純化各種多糖。 將純化的多糖化學(xué)活化以使得該糖能夠與載體蛋白反應(yīng)。
[0061] -旦活化，將每種莢膜多糖單獨(dú)綴合到載體蛋白以形成復(fù)合糖。在一個(gè)實(shí)施方案 中，每種莢膜多糖綴合到相同的載體蛋白。在該實(shí)施方案中，通過(guò)還原胺化實(shí)現(xiàn)綴合。
[0062] 通過(guò)常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)多糖的化學(xué)活化和隨后綴合到載體蛋白。見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào) 4, 673, 574 和 4, 902, 506 [34, 35]。
[0063] 載體蛋白優(yōu)選是無(wú)毒并且無(wú)反應(yīng)原性的蛋白質(zhì)并且可以以足夠的量和純度得到。 載體蛋白應(yīng)該適合標(biāo)準(zhǔn)的綴合步驟。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，將CRM 197用作載體蛋白。
[0064] CRM197OVyeth, Sanford, NC)是白喉毒素的非毒性變體（即，類毒素），該白喉毒 素從在酪蛋白氨基酸和基于酵母提取物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的白喉?xiàng)U菌（Corynebac t er i um diphtheria)菌株C7(P 197)的培養(yǎng)物中分離。通過(guò)超濾、硫酸銨沉淀和離子交換層析純化 CRM197。備選地，根據(jù)美國(guó)專利號(hào)5, 614, 382重組制備CRM197，將該專利引入本文作為參考。 其他白喉類毒素也適于用作載體蛋白。
[0065] 其他合適的載體蛋白包括滅活的細(xì)菌毒素，如破傷風(fēng)毒素、百日咳毒素、霍亂毒素 (例如，如國(guó)際專利申請(qǐng)W02004/083251中所述[38])、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、和來(lái)自銅 綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)的外毒素。也可以使用細(xì)菌外膜蛋白，如外膜復(fù)合 物c (OMPC)，孔蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A (PspA)、肺 炎球菌黏附素蛋白（PsaA)、來(lái)自鏈球菌組A或者組B的C5a肽酶、或者流感嗜血桿菌蛋白 D。其他蛋白質(zhì)，如卵白蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白（KLH)、牛血清白蛋白（BSA)或者結(jié)核菌素的純 化的蛋白質(zhì)衍生物（PPD)也可以用作載體蛋白。
[0066] 莢膜多糖綴合到載體蛋白后，通過(guò)多種技術(shù)純化多糖-蛋白質(zhì)綴合物（關(guān)于多 糖-蛋白質(zhì)綴合物的量的富集）。這些技術(shù)包括濃縮/滲濾操作、沉淀/洗脫、柱層析和深 層過(guò)濾（depth filtration)。見(jiàn)下面的實(shí)施例。
[0067] 純化各復(fù)合糖后，將它們配合以配制本發(fā)明的免疫原性組合物，其可以用作疫苗。 使用本領(lǐng)域公知的方法可以完成本發(fā)明的免疫原性組合物的配制。例如，可以用生理學(xué)上 可接受的載體配制13種各自的肺炎球菌綴合物以制備組合物。此類載體的實(shí)例包括，但不 限于，水、緩沖鹽水、多元醇（例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇）和葡萄糖溶液。
[0068] 在一些實(shí)施方案中，免疫原性組合物將包含一種或多種佐劑。如本文定義的，"佐 劑"是用于增強(qiáng)本發(fā)明免疫原性組合物的免疫原性的物質(zhì)。從而，通常給予佐劑以加強(qiáng)免 疫應(yīng)答并且佐劑是技術(shù)人員公知的。用于增強(qiáng)組合物的有效性的合適的佐劑包括，但不限 于：
[0069] (1)錯(cuò)鹽（alum)，如氣氧化錯(cuò)、憐酸錯(cuò)、硫酸錯(cuò)，等等；
[0070] (2)水包油乳液制劑（有或者沒(méi)有其他特定免疫刺激劑，如胞壁酰基肽（下文定 義）或者細(xì)菌細(xì)胞壁組分），如，
[0071] (&)]\^59(?(：1'公布號(hào)恥 90/14837)，含有5%鯊稀，0.5%了￥661180，和0.5%5口&11 85 (任選含有不同量的MTP-PE (見(jiàn)下文，盡管不是必需的），使用microfluidizer如IlOY 型 microf luidizer (Microf luidics，Newton，MA)配制成亞微米顆粒，
[0072] (b)SAF，含有10%鯊稀，0? 4% Tween 80,5%普盧蘭尼克阻斷的聚合物L(fēng)121，和 thr-MDP(見(jiàn)下文），微流化成亞微米乳液或者經(jīng)渦旋以產(chǎn)生較大顆粒大小的乳液，和
[0073] (c)Ribi?佐劑系統(tǒng)（RAS)，（Corixa，Hamilton，MT)，含有 2 % 鯊稀，0? 2 % Tween 80,和選自美國(guó)專利號(hào)4, 912, 094中描述的3-0-脫?；膯瘟姿嶂珹 (MPLtm) (Corixa)，海藻糖二霉菌酸酯（TDM)和細(xì)胞壁骨架（CWS)的一種或多種細(xì)胞壁組分，優(yōu)選 MPL+CWS(Detox?)；
[0074] (3)皂苷佐劑，可以使用如Quil A或STIMULONtm QS-21(Antigenics，F(xiàn)ramingham, MA)(美國(guó)專利號(hào)5, 057, 540)或者從其產(chǎn)生的顆粒，如 ISCOMs(免疫刺激復(fù)合物）；
[0075](4)細(xì)菌脂多糖，合成的脂類A類似物，如氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物（AGP)， 或者其衍生物或類似物，其可以從Corixa得到，并且在美國(guó)專利號(hào)6, 113,918中描 述；一種此類AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基氨基]乙基2-脫氧-4-0-膦酰 基-3-0- [ (R) -3-十四酰氧基十四?；鵠-2- [ (R) -3-十四酰氧基十四酰基氨基]-b-D-吡喃 葡萄糖苷，其也稱作529 (以前稱作RC529)，其配制為水性形式或者穩(wěn)定的乳劑，合成的多 核苷酸，如含有CpG基序的寡核苷酸（美國(guó)專利號(hào)6, 207, 646);
[0076] (5)細(xì)胞因子，如白介素（例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、 IL-18等），干擾素（例如，y干擾素），粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)，巨噬細(xì)胞 集落刺激因子（M-CSF)，腫瘤壞死因子（TNF)，共刺激分子B7-1和B7-2,等等；
[0077] (6)細(xì)菌ADP-核糖基化毒素的脫毒突變體，如野生型或者突變型的霍亂毒素 (CT)，例如，其中氨基酸位置29的谷氨酸由另一種氨基酸，優(yōu)選組氨酸替換（根據(jù)公布的 國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 00/18434(也見(jiàn)W002/098368和WO 02/098369))，百日咳毒素（PT)， 或者大腸桿菌不耐熱毒素（LT)，尤其是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129(見(jiàn)例如TO 93/13302 和 WO 92/19265);和
[0078] (7)作為免疫刺激劑以增強(qiáng)組合物的有效性的其他物質(zhì)。
[0079] 胞壁?；陌?，但不限于N-乙?；?胞壁酰基-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺 (thr-MDP)、N-乙?；?正胞壁?；?L-丙氨酸-2-(1' -2'二棕櫚?；?sn-甘油-3-羥基 磷酰基氧基）_乙胺（MTP-PE)等等。
[0080] 本發(fā)明的疫苗組合物可以用于保護(hù)或者治療對(duì)肺炎球菌感染敏感的人，這可通過(guò) 全身或者粘膜途徑施用疫苗來(lái)完成。這些施用可以包括通過(guò)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或者皮下途 徑注射，或者通過(guò)粘膜施用于口 /消化道、呼吸道或者泌尿生殖道。在一個(gè)實(shí)施方案中，鼻 內(nèi)施用用于治療肺炎或者中耳炎（因?yàn)榉窝浊蚓谋茄蕯y帶可以更有效預(yù)防，從而減輕在 其最早階段的感染）。
[0081]每個(gè)疫苗劑量中綴合物的量選擇為誘導(dǎo)免疫保護(hù)而無(wú)顯著副作用的量。此類量 可以取決于肺炎球菌血清型而變。通常，每劑將包含〇. 1到loo y g多糖，尤其包含〇. 1到 10 y g多糖，更尤其包含1到5 y g多糖。
[0082] 通過(guò)包括觀察受試者合適的免疫應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)研究可以確定具體疫苗的組分的最 佳量。最初接種后，受試者可以接受適當(dāng)間隔的一次或幾次加強(qiáng)免疫。
[0083] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，13vPnC疫苗是各自綴合到CRM197的血清型1、3、4、5、 6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F型的肺炎球菌莢膜多糖的無(wú)菌液體制劑。每0. 5mL劑 量被配制成含有：除了 4 y g6B之外，每種糖2 y g :約29 y g CRM197載體蛋白：0. 125mg元素 鋁（0. 5mg磷酸鋁）佐劑；和作為賦形劑的氯化鈉和琥珀酸鈉緩沖劑。將液體填充到?jīng)]有防 腐劑的單劑量注射器中。搖動(dòng)后，疫苗是均勻的，白色混懸液可用于肌內(nèi)施用。
[0084] 13vPnC疫苗的劑量水平的選擇類似于上市的7vPnC疫苗（Prevnar)。為所有血 清型選擇2 y g糖劑量水平，只是對(duì)于6B型為每劑4 y g。7vPnC疫苗對(duì)于血清型4、9V、14、 18C、19F和23F型在2 y g的糖劑量水平和對(duì)于6B型在4 y g的糖劑量水平已經(jīng)顯示出對(duì)于 iro的所希望的安全性、免疫原性和功效。
[0085] 免疫方案可以按照為7vPnC疫苗指定的方案。例如，針對(duì)由于13vPnC疫苗中包 括的血清型引起的肺炎鏈球菌侵入性疾病的嬰兒和剛學(xué)步的小孩的常規(guī)方案是2、4、6和 12-15個(gè)月的年齡。本發(fā)明的組合物也適于更大的兒童、青少年和成人使用。
[0086] 本發(fā)明的組合物可以還包括一種或多種額外的抗原，其用于抵抗其他細(xì)菌感染引 起的中耳炎。此類細(xì)菌包括非典型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenza)、粘膜炎莫拉菌 (Moraxella catarrhalis)(以前稱作粘膜炎布蘭漢球菌（Branhamella catarrhalis))和 耳炎差異球菌（Alloiococcus otitidis)。
[0087] 適于包括的非典型流感嗜血桿菌抗原的實(shí)例包括P4蛋白，也稱作蛋白"e"（美國(guó) 專利號(hào)5,601,831 ;國(guó)際專利申請(qǐng)TO03/078453)，P6蛋白，也稱作PAL或者PB0MP-1蛋白 (美國(guó)專利號(hào)5，110,908;國(guó)際專利申請(qǐng)冊(cè)0100790)，？5蛋白（美國(guó)再版專利號(hào)37,741)，嗜 血桿菌粘附和穿透蛋白（美國(guó)專利號(hào)6, 245, 337和6, 676, 948)，LKP尖端黏附素蛋白（美 國(guó)專利號(hào)5, 643, 725)和NucA蛋白（美國(guó)專利號(hào)6, 221，365)。
[0088] 適于包括的粘膜炎莫拉菌抗原的實(shí)例包括UspA2蛋白（美國(guó)專利號(hào)5, 552, 146， 6, 310, 190)，CD蛋白（美國(guó)專利號(hào)5, 725, 862)，E蛋白（美國(guó)專利號(hào)5, 948, 412)和74千 道爾頓外膜蛋白（美國(guó)專利號(hào)6, 899, 885)。
[0089] 適于包括的耳炎差異球菌抗原的實(shí)例包括國(guó)際專利申請(qǐng)W003/048304中鑒定的 那些。
[0090] 本發(fā)明的組合物還可以包括一種或多種來(lái)自肺炎鏈球菌的蛋白質(zhì)。適于包括的肺 炎鏈球菌蛋白質(zhì)的實(shí)例包括國(guó)際專利申請(qǐng)W002/083855中鑒定的那些以及國(guó)際專利申請(qǐng) W002/053761中描述的那種。
[0091] 本發(fā)明的組合物可以還包括一種或多種來(lái)自B型腦膜炎茶瑟氏球菌（Neisseria meningitidis)的蛋白質(zhì)。適于包括的B型腦膜炎茶瑟氏球菌蛋白質(zhì)的實(shí)例包括國(guó)際專利 申請(qǐng) W003/063766, W02004/094596, W001/85772, W002/16612 和 W001/87939 中鑒定的那些。
[0092] 用于綴合的肺炎鏈球菌血清型1型多糖的活化
[0093] 多糖中部分氧化的糖已有效地用于生成醛基，隨后該基團(tuán)偶聯(lián)到載體蛋白的賴氨 酸殘基生成免疫原性綴合物（即，組合物，例如疫苗，用于在脊椎動(dòng)物中刺激或引起具體的 免疫應(yīng)答）。生成醛基的通常的必要條件是存在鄰位的（鄰近的）羥基。一些多糖中，一些 羥基基團(tuán)由于被其他官能團(tuán)阻斷而不可用。在Pn 1情況中，〇-乙?；怯行а趸囊粋€(gè) 障礙，并且選擇性地去除這些基團(tuán)的一些（即，氧化前進(jìn)行多糖的溫和脫氧乙?；┯兄?氧化和促進(jìn)綴合的效率。
[0094] 為保持氧化反應(yīng)的一致性直至達(dá)到理想程度，Pn1多糖首先在堿性pH緩沖液中 通過(guò)溫和水解而部分脫氧乙?；５湫偷膲A性pH緩沖液包括，但不限于，碳酸氫鹽/碳酸 鹽緩沖液（例如碳酸氫鈉/碳酸鈉），甘氨酸，咪唑，和TRIS-EDTA。脫氧乙酰化接著是使用 弱酸進(jìn)行中和，例如乙酸，檸檬酸或碳酸，或低離子強(qiáng)度無(wú)機(jī)酸（例如，鹽酸）。中和之后使 用控制量的氧化劑而實(shí)現(xiàn)部分氧化以產(chǎn)生"活化的"Pn1多糖?？梢圆捎萌魏芜x擇性的氧 化劑以氧化末端羥基為醛基，包括具體的糖氧化酶，（例如，高碘酸鈉或鉀）。然后活化的Pn 1多糖任選地純化（例如，通過(guò)以緩沖鹽滲濾）。
[0095] 活化的Pn 1多糖可以與載體蛋白配合。選擇載體蛋白以增加結(jié)合的Pn 1多 糖的免疫原性和/或引起抗載體蛋白的抗體，其是診斷，分析和/或治療有益的?？乖?分子（例如多糖）到載體的共價(jià)連接賦予增強(qiáng)的免疫原性和T細(xì)胞依賴（Pozsgay等人 (1999) PNAS，96:5194-97 ;Lee 等人（1976) J. Immunol.，116:1711-18 ;Dintzis 等人（1976) PNAS，73:3671-75)。正如本文所述，有益的載體蛋白質(zhì)包括滅活細(xì)菌毒素，如破傷風(fēng)類毒 素、百日咳毒素、霍亂毒素（如國(guó)際專利申請(qǐng)W02004/083251所述）、大腸桿菌LT、大腸桿菌 ST和銅綠假單胞菌的外毒素A。也可以使用細(xì)菌外膜蛋白，如外膜復(fù)合物c、孔蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋 白結(jié)合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎鏈球菌表面蛋白A、肺炎鏈球菌黏附素蛋白、鏈球菌A組 或B組的C5a肽酶、或流感嗜血桿菌蛋白D。其他蛋白質(zhì)，如卵白蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白、牛血 清白蛋白，或純化的結(jié)核菌素蛋白衍生物也可作為載體蛋白質(zhì)。優(yōu)選的載體蛋白是突變的 白喉毒素CRM 197。與載體蛋白配合后，活化的Pn 1多糖/載體蛋白混合物任選地冷凍（例 如殼式冷凍（shell frozen))并共凍干。
[0096] 綴合是通過(guò)將活化的Pn1多糖/載體蛋白混合物與還原劑反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)，例如氰基 硼氫化鈉。未反應(yīng)的醛隨后通過(guò)硼氫化鈉還原封閉。綴合物經(jīng)純化（例如，通過(guò)用磷酸鹽 緩沖液，接著緩沖鹽滲濾），得到在緩沖鹽溶液中的復(fù)合糖的最終批次濃縮物。
[0097] 上面的公開(kāi)一般性描述了本發(fā)明。通過(guò)下面的特定實(shí)施例可以更完全地理解本發(fā) 明。這些實(shí)例僅僅用于闡明的目的并且不意在限定本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例
[0098] 實(shí)施例1
[0099] 制備肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型1型
[0100] 制備主細(xì)朐庫(kù)和工作細(xì)朐庫(kù)
[0101] 從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC菌株6301得到肺炎鏈球菌血清型1型。產(chǎn)生幾 代種子原種以便擴(kuò)大菌株和除去動(dòng)物來(lái)源的組分（F1，F(xiàn)2和F3代）。產(chǎn)生兩個(gè)額外代的種 子原種。從F3瓶得到第一額外的世代，從第一個(gè)額外世代瓶得到隨后的世代。冷凍保存 (<-70°C)種子瓶，用合成的甘油作為冷凍保藏劑。除了冷凍瓶外，對(duì)于F4代制備凍干的瓶。 為了制備細(xì)胞庫(kù)，在基于大豆的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)所有培養(yǎng)物。冷凍前，通過(guò)離心濃縮細(xì)胞，除 去用盡的培養(yǎng)基，將細(xì)胞沉淀物重懸浮在含有冷凍保藏劑如合成甘油的新鮮培養(yǎng)基中。
[0102] 發(fā)酵和收獲
[0103] 來(lái)自工作細(xì)胞庫(kù)的培養(yǎng)物用于接種含有基于大豆的培養(yǎng)基的種子瓶。將瓶子在 36°C ±2°C，不攪拌下溫育直到滿足生長(zhǎng)要求。種子瓶用于接種含有基于大豆的培養(yǎng)基的種 子發(fā)酵罐。用無(wú)菌碳酸鈉溶液保持約7.0的pH。達(dá)到目標(biāo)光密度后，用種子發(fā)酵罐接種含 有基于大豆的培養(yǎng)基的生產(chǎn)發(fā)酵罐。用無(wú)菌碳酸鈉溶液保持pH。生長(zhǎng)停止后或者達(dá)到發(fā)酵 罐的工作體積后終止發(fā)酵。向培養(yǎng)