物加入合適量的無菌的12%脫氧膽酸鈉以裂解細(xì)菌細(xì)胞 和釋放細(xì)胞相關(guān)的多糖。裂解后，冷卻發(fā)酵罐內(nèi)容物。用乙酸調(diào)節(jié)裂解的培養(yǎng)液的PH到約 pH 6.6。通過連續(xù)流動(dòng)離心接著深層過濾和0.45 ym微孔過濾澄清裂解物。
[0104] 在備選方法中，用3N NaOH保持約7.0的發(fā)酵pH。達(dá)到目的光密度后，用種子發(fā)酵 罐接種含有基于大豆的培養(yǎng)基的生產(chǎn)發(fā)酵罐。用3N NaOH保持pH。生長(zhǎng)停止后或者達(dá)到發(fā) 酵罐的工作體積后終止發(fā)酵。向培養(yǎng)物加入合適量的無菌的12%脫氧膽酸鈉以在培養(yǎng)液中 得到0. 12%的濃度，以裂解細(xì)菌細(xì)胞和釋放細(xì)胞結(jié)合的多糖。裂解后，在7°C到13°C的溫 度下，進(jìn)行攪拌并對(duì)發(fā)酵罐內(nèi)容物保持8到24小時(shí)的時(shí)間間隔，以確保已經(jīng)發(fā)生了完全的 細(xì)胞裂解和多糖釋放。該保持期間的攪拌防止裂解沉積物沉淀在發(fā)酵罐壁和PH探頭上，從 而允許保持pH探頭完整性。接著，將裂解的細(xì)胞培養(yǎng)液的pH用50%乙酸調(diào)節(jié)到約pH5. 0。 無攪拌下，在15°C到25' C的溫度下保持12到24小時(shí)的時(shí)間間隔后，顯著量的之前溶解的 蛋白質(zhì)作為固體沉淀物從溶液析出，多糖幾乎沒有損失或者降解，其仍保留在溶液中。然后 通過連續(xù)流動(dòng)離心，接著通過深層過濾和0. 45 y m微孔過濾澄清具有沉淀物的溶液。
[0105] 純化
[0106] 肺炎球菌多糖的純化由幾個(gè)濃縮/滲濾操作、沉淀/洗脫、柱層析和深層過濾步驟 組成。除非另外指出，所有步驟都在室溫下進(jìn)行。
[0107] 用IOOkDaMffCO(千道爾頓分子量截留）濾器將來自肺炎鏈球菌血清型1型的發(fā) 酵罐培養(yǎng)物的經(jīng)澄清的培養(yǎng)液濃縮并滲濾。使用中性PH的磷酸鈉緩沖液完成滲濾。滲濾 從較高分子量的生物聚合物，如核酸、蛋白質(zhì)和多糖除去了低分子量的培養(yǎng)基組分。
[0108] 通過加入來自貯存液的十六烷基三甲基溴化銨（HB)以得到1% HB(w/v)的終濃 度，從經(jīng)濃縮和滲濾的溶液沉淀多糖。在深層濾器上捕獲多糖/HB沉淀物并丟棄濾液。再 溶解多糖沉淀物并使用再循環(huán)氯化鈉溶液通過含有沉淀物的深層濾器進(jìn)行洗脫。然后用額 外的氯化鈉溶液沖洗濾器。
[0109] 向多糖溶液中加入來自碘化鈉（NaI)貯存液的NaI至終濃度為0. 5 %以沉淀HB。 通過深層過濾除去沉淀物。濾液含有目標(biāo)多糖。用NaCl/Nal溶液沖洗沉淀容器和濾器并 將沖洗液與部分純化的多糖溶液合并。丟棄濾器。然后通過0.2 ym濾器過濾多糖。
[0110] 將多糖溶液在30kDa MffCO超濾膜上濃縮并用氯化鈉溶液滲濾。
[0111] 通過浸漬活性炭的深層濾器過濾，進(jìn)一步純化部分純化的多糖溶液。過濾后，用氯 化鈉溶液沖洗碳濾器。將沖洗液與多糖溶液合并，然后將其通過0. 2 ii m濾器過濾。
[0112] 將多糖溶液在30kDa MffCO超濾膜上濃縮并用IM磷酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)以實(shí)現(xiàn)0. 025M 終濃度的磷酸鈉。檢查pH并調(diào)節(jié)到7. 0±0. 2。
[0113] 用含有氯化鈉的磷酸鈉緩沖液平衡陶瓷羥基磷灰石（HA)柱，以得到合適的電導(dǎo) 率（〈15 yS)。然后將多糖溶液裝載到柱子上。在這些條件下，雜質(zhì)結(jié)合到樹脂并且從柱子 的洗脫液回收多糖。多糖溶液通過位于柱子之前和之后的〇. 2 ym線內(nèi)濾器過濾。
[0114] 使用30kDa MffCO濾器濃縮多糖溶液。然后用注射用水（WFI)滲濾濃縮液。
[0115] 將滲濾的多糖溶液通過0. 2 ixm濾膜過濾到聚丙烯瓶中。取出樣品用于釋放測(cè)試 (release testing)并將純化的多糖在-25° ±5°C冷凍保藏。
[0116]表征
[0117] 通過指定給多糖分子的質(zhì)子的信號(hào)的分配，IH-NMR數(shù)據(jù)與化學(xué)結(jié)構(gòu)相一致。 IH-NMR譜顯示一系列分辨率良好的信號(hào)（來自甲基的質(zhì)子），其用以定量多糖中的0-乙酰 基官能團(tuán)。
[0118] 使用特異性抗血清，通過對(duì)流免疫電泳證實(shí)單價(jià)多糖的身份。
[0119] 使用配備折射率和多角度激光散射（MLLS)檢測(cè)器的高效凝膠過濾層析和樣品 濃縮物以計(jì)算分子量。
[0120] 用大小排阻層析介質(zhì)（CL-4B)描繪多糖的相對(duì)分子大小分布。
[0121] 實(shí)施例2
[0122] 制備血清型1型肺炎球菌糖-CRM197綴合物
[0123] 活化和綴合
[0124] 將含純化的多糖的容器解凍并合并到反應(yīng)容器中。向容器中加入pH9.0的0.2M 碳酸鈉用于在50°C部分脫乙?；ㄋ猓?小時(shí)。將反應(yīng)物冷卻到20°C并通過0. 2M乙酸 進(jìn)行中和。通過在2-8°C溫育，在高碘酸鈉存在下進(jìn)行氧化，并攪拌混合物15-21小時(shí)。
[0125] 濃縮活化反應(yīng)混合物并使用30K MffCO膜用0. 9% NaCl滲濾10次。將存留物用 0.2y m濾膜過濾.將活化的糖裝入IOOmL玻璃凍干瓶中并在-75°c殼式冷凍并凍干。
[0126] "殼式冷凍"是一種制備用于凍干（冷凍干燥）的樣品的方法。在含有醇或任何其 他合適的液體的冷凍水浴中通過電機(jī)驅(qū)動(dòng)的滾筒自動(dòng)旋轉(zhuǎn)燒瓶。產(chǎn)物的薄涂層圍繞瓶的內(nèi) "殼"均勻冷凍，允許在每次冷凍干燥運(yùn)行期間安全地處理更大體積的物質(zhì)。這些自動(dòng)化的 冷凍單元提供了一次預(yù)冷凍許多燒瓶的簡(jiǎn)單和有效的方法，在內(nèi)部產(chǎn)生所希望的涂層，并 為有效的冷凍干燥提供了足夠的表面積。
[0127] 將含經(jīng)凍干物質(zhì)的瓶恢復(fù)到室溫并以糖/蛋白質(zhì)比為2:1重懸浮在CRM 197溶液中。 向該糖/蛋白質(zhì)混合物中加入IM磷酸鈉緩沖液至最終0. 2M離子濃度和7. 5的pH，然后加 入氰基硼氫化鈉。反應(yīng)物在23°C溫育18小時(shí)，接著在37°C再次溫育72小時(shí)。氰基硼氫化 物溫育后，用冷的鹽水稀釋反應(yīng)混合物，接著加入IM碳酸鈉以調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物到pH9. 0。通 過加入硼氫化鈉，在23°C溫育3-6小時(shí)淬滅未反應(yīng)的醛。
[0128] 將反應(yīng)混合物用鹽水稀釋2倍并通過0. 45-5 ym預(yù)過濾器轉(zhuǎn)移到存留物容器中。 用0. 15M磷酸鹽緩沖液（pH 6)滲濾反應(yīng)混合物30次，用鹽水滲濾20次。通過0. 2 y m濾 器過濾存留物。
[0129] 將綴合物溶液用0. 9 %鹽水稀釋到0. 5mg/mL的目標(biāo)濃度，然后在Class 100通風(fēng)廚 中無菌過濾到最終體相濃縮物（final bulk concentrate) (FBC)容器中。綴合物在2-8°C 保存。
[0130]表征
[0131] 用大小排阻層析介質(zhì)（CL-4B)描繪綴合物的相對(duì)分子大小分布。
[0132] 使用特異抗血清通過狹線印跡測(cè)定法證實(shí)綴合物的身份。
[0133] 分別通過糖醛酸和Lowry測(cè)定法測(cè)定糖和蛋白質(zhì)濃度。通過下面的計(jì)算得到共價(jià) 結(jié)合的綴合物復(fù)合物中糖與蛋白質(zhì)的比率：
[0134]
[0135]通過Hestrin方法（Hestrin等人，J.Biol.Chem. 1949, 180，第 249 頁）測(cè)量 〇-乙 酰基含量。〇-乙酰基濃度與總糖濃度的比率得到每毫克糖的〇-乙?；⒛枖?shù)。
[0136] 實(shí)施例3
[0137] 制備肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型3型
[0138] 制備主細(xì)朐庫和工作細(xì)朐庫
[0139] 肺炎鏈球菌血清型3型從賓夕法尼亞州費(fèi)城賓夕法尼亞大學(xué)的RobertAustrian 博士處得到。細(xì)胞庫系統(tǒng)的制備見實(shí)施例1。
[0140] 發(fā)酵和收獲
[0141] 來自工作細(xì)胞庫的培養(yǎng)物用于接種含有基于大豆的培養(yǎng)基的種子瓶。將瓶子在 36°C ±2°C無攪拌下溫育，直到滿足生長(zhǎng)需要。用種子瓶接種含有基于大豆的培養(yǎng)基的種子 發(fā)酵罐。用無菌碳酸鈉溶液保持pH約7.0。達(dá)到目標(biāo)光密度后，用種子發(fā)酵罐接種中間種 子發(fā)酵罐。達(dá)到目標(biāo)光密度后，用中間種子發(fā)酵罐接種生產(chǎn)發(fā)酵罐。用無菌碳酸鈉溶液保 持pH。達(dá)到發(fā)酵罐的工作體積后終止發(fā)酵。向培養(yǎng)物中加入合適量的無菌12%脫氧膽酸 鈉以裂解細(xì)菌細(xì)胞和釋放細(xì)胞相關(guān)的多糖。裂解后，冷卻發(fā)酵罐內(nèi)容物。用乙酸調(diào)節(jié)裂解 的培養(yǎng)液的PH到約pH6. 6。通過連續(xù)流動(dòng)離心接著深層過濾和0. 45 ym微孔過濾澄清裂解 物。
[0142] 純化
[0143] 肺炎球菌多糖的純化由幾個(gè)濃縮/滲濾操作、沉淀/洗脫、柱層析和深層過濾步驟 組成。除非另外指出，所有步驟都在室溫下進(jìn)行。
[0144] 用IOOkDaMffCO濾器將來自肺炎鏈球菌血清型3型的發(fā)酵罐培養(yǎng)物的經(jīng)澄清的培 養(yǎng)液濃縮并滲濾。使用中性pH的磷酸鈉緩沖液完成滲濾。滲濾從較高分子量的生物聚合 物，如核酸、蛋白質(zhì)和多糖除去了低分子量的培養(yǎng)基組分。
[0145] 加入十六烷基三甲基溴化銨（HB)前，向經(jīng)濃縮和滲濾的多糖溶液中加入經(jīng)計(jì)算 體積的NaCl貯存液以得到0. 25MNaCl的終濃度。然后加入來自貯存液的HB至得到1% HB(w/v)的終濃度以沉淀多糖。在深層濾器上捕獲多糖/HB沉淀物并丟棄濾液。再溶解多 糖沉淀物并通過再循環(huán)氯化鈉溶液對(duì)含有沉淀物的深層濾器進(jìn)行洗脫。然后用額外的氯化 鈉溶液沖洗濾器.
[0146] 向多糖溶液中加入來自碘化鈉（NaI)貯存液的NaI至終濃度0. 5%以沉淀HB。通 過深層過濾除去沉淀物。濾液含有目標(biāo)多糖。用NaCl/Nal溶液沖洗沉淀容器和濾器并將 沖洗液與部分純化的多糖溶液合并。丟棄濾器。然后通過0.2ym濾器過濾多糖。
[0147] 將多糖溶液在30kDa MffCO超濾膜上濃縮并用氯化鈉溶液滲濾。
[0148] 通過浸漬活性炭的深層濾器過濾，進(jìn)一步純化部分純化的多糖溶液。過濾后，用氯 化鈉溶液沖洗碳濾器。將沖洗液與多糖溶液合并，然后將其通過〇. 2 y m濾器過濾。
[0149] 將多糖溶液在30kDaMffCO超濾膜上濃縮并用IM磷酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)以實(shí)現(xiàn)0. 025M 終濃度的磷酸鈉。檢查pH并調(diào)節(jié)到7. 0±0. 2。
[0150] 用含有氯化鈉的磷酸鈉緩沖液平衡陶瓷羥基磷灰石（HA)柱，以得到合適的電導(dǎo) 率（15 yS)。然后將多糖溶液裝載到柱子上。在這些條件下，雜質(zhì)結(jié)合到樹脂并且從柱子的 洗脫液回收多糖。用緩沖液沖洗柱子釋放多糖并通過〇. 2 y m濾器過濾多糖。
[0151] 使用30kDaMffCO濾器濃縮多糖溶液。然后用WFI滲濾濃縮液。
[0152] 將滲濾的多糖溶液通過0. 2ym濾膜過濾到不銹鋼容器中。取出樣品用于釋放測(cè) 試并將純化的多糖在-25° ±5°C冷凍保藏。
[0153] 表征
[0154] 通過指定給多糖分子的質(zhì)子的信號(hào)的分配，IH-NMR數(shù)據(jù)與化學(xué)結(jié)構(gòu)相一致。
[0155] 使用特異性抗血清，通過對(duì)流免疫電泳證實(shí)單價(jià)多糖的身份。
[0156] 使用配備折射率和多角度激光散射（MLLS)檢測(cè)器的高效凝膠過濾層析和樣品 濃縮物計(jì)算分子量。
[0157] 用大小排阻層析介質(zhì)（CL-4B)描繪多糖的相對(duì)分子大小分布。
[0158] 實(shí)施例4
[0159] 血清型3型肺炎球菌糖-CRM197綴合物的制備
[0160] 活化和綴合
[0161] 將含純化的血清型3型糖的容器解凍并合并在反應(yīng)容器中。向該容器中加入WFI 和2M乙酸至終濃度0. 2M和2mg/ml糖。將溶液的溫度升高到85°C 1小時(shí)以水解多糖。冷 卻反應(yīng)物到< 25°C并加入IM氯化鎂至終濃度為0. 1M。通過在23°C溫育16-24小時(shí)，在高 碘酸鈉存在下進(jìn)行氧化。
[0162] 使用100KMffCO膜濃縮活化反應(yīng)混合物并用WFI滲濾10次。通過0. 2-ym濾器 過濾存留物。
[0163] 為了配制，向活化的糖中加入0. 2M磷酸鈉（pH7. 0)至IOmM終濃度和6. 0-6. 5的 pH。將CRM197載體蛋白與糖溶液混合至2g糖/lg CRM 197的比率。將合并的糖/蛋白質(zhì)溶液 裝入IOOmL玻璃凍干瓶中，目標(biāo)填充為50mL，在-75°C殼式冷凍，并凍干。
[0164] 使含共同凍干的糖/蛋白質(zhì)物質(zhì)瓶恢復(fù)至室溫，并重懸浮在0.IM磷酸鈉緩沖液 (pH7. 0)中至20mg/mL的最終糖濃度。調(diào)節(jié)pH到6. 5,然后加入0. 5摩爾當(dāng)量的氰基硼氫 化鈉。在37°C溫育反應(yīng)物48小時(shí)。氰基硼氫化物溫育后，用冷的5mM琥珀酸鹽/0. 9 %鹽 水緩沖液稀釋反應(yīng)混合物。通過加入硼氫化鈉并在23°C溫育3-6小時(shí)淬滅未反應(yīng)的醛。通 過0. 45-5 y m預(yù)過濾器轉(zhuǎn)移反應(yīng)混合物到存留物容器中。
[0165] 用0.1 M磷酸鹽緩沖液（pH9)滲濾反應(yīng)混合物30次，用0. 15M磷酸鹽緩沖液（pH6) 滲濾反應(yīng)混合物20次，用5mM琥珀酸鹽/0. 9 %鹽水滲濾反應(yīng)混合物20次。通過0. 2- y m 濾器過濾存留物。
[0166] 將綴合物溶液稀釋到目標(biāo)糖濃度為0.5mg/mL，然后在Class100通風(fēng)廚中無菌過 濾到FBC容器中。在2-8 °C保存綴合物。
[0167] 表征
[0168] 用大小排阻層析介質(zhì)（CL-4B)描繪綴合物的相對(duì)分子大小分布。
[0169] 使用特異抗血清通過狹線印跡測(cè)定法證實(shí)綴合物的身份。
[0170] 分別通過Anthrone和Lowry測(cè)定法測(cè)定糖和蛋白質(zhì)濃度。通過下面的計(jì)算得到 共價(jià)結(jié)合的綴合物復(fù)合物中糖與蛋白質(zhì)的比率：
[0171]
[0172] 實(shí)施例5
[0173] 制備肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型5型
[0174]肺炎鏈球菌血清型 5 型從GeraldSchiffman博士（StateUniversityofNew Y〇rk，Br〇〇klyn，NeWYork)得到。細(xì)胞庫系統(tǒng)的制備見實(shí)施例1。發(fā)酵、收獲、多糖的純化 和表征見實(shí)施例1。
[0175]備詵發(fā)酵方法
[0176] 來自工作細(xì)胞庫的培養(yǎng)物用于接種含有基于大豆的培養(yǎng)基和IOmM無菌NaHOV^ 液的種子瓶。將瓶子在36°C±2°C無攪拌下溫育直到滿足生長(zhǎng)要求。用種子瓶接種含有基 于大豆的培養(yǎng)基和IOmM無菌NaHCO3溶液的種子發(fā)酵罐。用3NNaOH保持pH約7. 0。達(dá)到 目標(biāo)光密度后，用種子發(fā)酵罐接種含有基于大豆的培養(yǎng)基與IOmM濃度的NaHCOj^生產(chǎn)發(fā) 酵罐。用3NNaOH保持pH。生長(zhǎng)停止后或者達(dá)到發(fā)酵罐的工作體積時(shí)停止發(fā)酵。向培養(yǎng)物 中加入合適量的無菌12%脫氧膽酸鈉以得到其在培養(yǎng)液中的濃度為0. 12%，以裂解細(xì)菌 細(xì)胞和釋放細(xì)胞相關(guān)的多糖。裂解后，攪拌下，在7°C到13°C的溫度下保持發(fā)酵罐內(nèi)容物8 到24小時(shí)的時(shí)間間隔，以確保已經(jīng)發(fā)生了完全細(xì)胞裂解和多糖釋放。該保持期間的攪拌防 止裂解沉積物沉淀在發(fā)酵罐壁和pH探頭上，從而允許保持pH探頭完整性。接著，將裂解的 細(xì)胞培養(yǎng)液的pH用50%乙酸調(diào)節(jié)到約pH4. 5。無攪拌下，在15°C到25°C的溫度下保持12 到24小時(shí)的時(shí)間間隔后，顯著部分的以前溶解的蛋白質(zhì)作為固體沉淀物從溶液析出，多糖 幾乎沒有損失或者降解，其仍保留在溶液中。然后通過連續(xù)流動(dòng)離心，接著通過深層過濾和 0. 45 y m微孔過濾澄清具有沉淀物的溶液。
[0177] 實(shí)施例6
[0178] 制備血清型5型肺炎球菌糖-CRM197綴合物
[0179]活化和綴合
[0180] 將含血清型5型糖的容器解凍并合并在反應(yīng)容器中。向該容器中加入0.1 M乙酸 鈉（pH4. 7)，接著在高碘酸鈉存在下通過在23°C溫育16-22小時(shí)進(jìn)行氧化。
[0181] 使用100K MffCO膜濃縮活化反應(yīng)混合物并用WFI滲濾10次。通過0. 2- y m濾器 過濾存留物。
[0182] 將血清型5型活化的糖與CRM197以0. 8:1的比例合并。將合并的糖/蛋白質(zhì)溶液 裝入IOOmL玻璃凍干瓶（50mL目標(biāo)填充）中并在-75°C殼式冷凍，并共同凍干。
[0183] 讓含共同凍干的物質(zhì)的瓶子恢復(fù)到室溫并重懸浮在0.IM磷酸鈉（pH7. 5)中，加 入氰基硼氫化鈉。反應(yīng)物在30°C溫育72小時(shí)，接著再次加入氰基硼氫化鈉并在30°C溫育 20-28小時(shí)。
[0184] 氰基硼氫化鈉溫育后，用鹽水稀釋反應(yīng)混合物2倍并通過0. 45-5 y m預(yù)過濾器轉(zhuǎn) 移到存留物容器中。將反應(yīng)混合物用0.OlM磷酸鹽緩沖液（pH8)滲濾30次，用0. 15M磷酸 鹽緩沖液（PH6)滲濾20次，并用鹽水滲濾20次。通過0. 2 y m濾器過濾存留物。
[0185] 將綴合物溶液稀釋到糖目標(biāo)濃度為0. 5mg/mL，然后在Class 100通風(fēng)廚中無菌過 濾到FBC容器中。在2-8 °C保存綴合物。
[0186] 綴合物的表征見實(shí)施例2。
[0187] 實(shí)施例7
[0188] 制備肺炎鏈球菌賽臘多糖血清銦6A姻
[0189] 從 Gerald SchifTman 博士（State University of New York, Brooklyn, New York)得到肺炎鏈球菌血清型6A型。細(xì)胞庫系統(tǒng)的制備見實(shí)施例1。發(fā)酵、收獲和多糖的 純化見實(shí)施例1，只是在純化期間，在層析步驟前省略了 30kDa MffCO濃縮步驟。
[0190] 實(shí)施例8
[0191] 制備血清型6A型肺炎球菌糖-CRM197綴合物
[0192] 活化和綴合
[0193] 血清型6A型多糖是高分子量聚合物，其必須在氧化前減小大小。解凍含血清型 6A型糖的容器并將其合并在反應(yīng)容器中。向容器中加入2M乙酸至0.1 M的終濃度，用于在 60°C水解1. 5小時(shí)。將反應(yīng)物冷卻到23°C并通過用IM NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物至pH6進(jìn)行中 和。在高碘酸鈉存在下，通過在23°C溫育14-22小時(shí)進(jìn)行氧化。
[0194]