長(zhǎng)非編碼核糖核酸nonratt021972小干擾核糖核酸在制備糖尿病并發(fā)神經(jīng)病理痛藥物中 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及糖尿病并發(fā)神經(jīng)病理痛藥物用途發(fā)明領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿?。―iabetesMellitus，DM)是一組代謝性臨床綜合征，隨著社會(huì)的發(fā)展和人 們生活水平的提高糖尿病的患病率逐年升高，在發(fā)達(dá)國(guó)家糖尿病患病率已達(dá)3 % -7 %，成 為僅次于癌癥、艾滋病、心腦血管病之后第4位需要優(yōu)先考慮的疾病，已成為世界第5位死 亡主因。糖尿病分為1型（胰島素依賴性）和2型（非胰島素依賴性）糖尿病。據(jù)估計(jì)， 全球六個(gè)人里面就有一個(gè)人處于患糖尿病并發(fā)癥的危險(xiǎn)中。我國(guó)糖尿病人群的構(gòu)成以2型 糖尿病為主，占糖尿病人群的90%以上，嚴(yán)重影響著人民健康和社會(huì)發(fā)展。糖尿病神經(jīng)病變 是常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥之一，其最常見(jiàn)的神經(jīng)病變類(lèi)型是周?chē)窠?jīng)損傷，如手，足。糖尿病 是低度炎性疾病，炎性物質(zhì)可加重糖尿病并發(fā)神經(jīng)損傷。糖尿病并發(fā)的周?chē)窠?jīng)病變以感 覺(jué)異常為主，其中以疼痛最痛苦、最顯著。臨床多見(jiàn)于血糖控制不佳的患者，常表現(xiàn)為遠(yuǎn)端 肢體自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏、異常性疼痛（如燒灼感、蟻?zhàn)吒谢蜥槾谈校┑?，?duì)于這些異常性 感覺(jué)的治療方法很局限，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致終身殘疾。因此，對(duì)于糖尿病神經(jīng)病理痛的防治工作已 成為糖尿病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。
[0003] 在19世紀(jì)70年代初Burnstock提出"嘌呤能神經(jīng)學(xué)說(shuō)"后，作為神經(jīng)遞質(zhì)的ATP 的研究工作倍受關(guān)注。嘌呤類(lèi)物質(zhì)包括三磷酸腺苷（ATP)以及其代謝產(chǎn)物二磷酸腺苷/ 一 磷酸腺苷（ADP/AMP)和腺苷等均參與信息傳遞。胞外核苷酸的受體稱為P2受體，ATP及其 類(lèi)似物作用于P2受體。P2受體分為配體門(mén)控性離子通道型受體（P2X受體）和G蛋白偶聯(lián) 型受體（P2Y受體）。目前已克隆出7種P2X受體亞型（P2XpP2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6、 P2X7)和 8 種P2Y受體亞型（PSYpPSYpPSYpPSYpPSYmPSYmPSYmPSYM)。疼痛、傷害性 刺激使損傷細(xì)胞、應(yīng)激細(xì)胞和感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放大量ΑΤΡ，ATP及其作用的P2X受體涉及痛 覺(jué)及傷害性信息在初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的傳遞。其中主要是P2X3受體參與初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的 痛覺(jué)及傷害性信息傳遞?；蚯贸齈2X3受體或應(yīng)用選擇性P2X3受體拮抗劑A317491可降 低P2X3受體的表達(dá)減輕模型動(dòng)物神經(jīng)病理痛痛行為。
[0004] 隨著基因組測(cè)序計(jì)劃的完成以及新一代深度測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中多于95%的轉(zhuǎn)錄序列為非編碼核糖核酸（noncodingRNA，ncRNA)。非編碼RNA是一 類(lèi)不編碼蛋白質(zhì)但具有生物學(xué)調(diào)控功能的RNA分子，它可通過(guò)參與mRNA的穩(wěn)定和翻譯水平 的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的運(yùn)輸、RNA的加工和修飾以及影響染色體的結(jié)構(gòu)等機(jī)制，調(diào)控生物體的基 本生命活動(dòng)，同時(shí)與一些重要疾病的病理生理過(guò)程相關(guān)。非編碼RNA包括短非編碼核糖核 酸（包括siRNA、miRNA、piRNA)和長(zhǎng)非編碼核糖核酸（longnon-codingRNA,IncRNA)。長(zhǎng) 度大于200個(gè)堿基（200nt)為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)。目前長(zhǎng)度小于50個(gè)核苷酸的非編 碼RNA(如microRNA、siRNA和piRNA)等的研究已取得突破性進(jìn)展，但對(duì)具有功能的長(zhǎng)非編 碼RNA的研究不多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA的第 一個(gè)新用途，即長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸在制備治療糖尿病并發(fā) 神經(jīng)病理痛疾病藥物中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA的第 二個(gè)新用途，即長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸在制備糖尿病并發(fā)神經(jīng) 損傷疾病藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA的第 三個(gè)新用途，即長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸在制備治療糖尿病并發(fā) 感覺(jué)神經(jīng)炎性相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明用SOLiD高通量測(cè)序并通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分子生物學(xué)驗(yàn)證確定大鼠 背根神經(jīng)節(jié)（DRG)存在長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972[http://www·noncode·org]，并 發(fā)現(xiàn)糖尿病模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972表達(dá)較對(duì)照組明顯增 加，提示背根神經(jīng)節(jié)的長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972與糖尿病引發(fā)的感覺(jué)神經(jīng)病理變 化有關(guān)。
[0009] 本發(fā)明通過(guò)2型糖尿病大鼠模型，觀察長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾 RNA處理后2型糖尿病大鼠痛行為的變化，以及與介導(dǎo)神經(jīng)病理痛的？2心受體表達(dá)變化的 關(guān)系，為長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA用于糖尿病并發(fā)神經(jīng)病理痛的預(yù)防 和治療提供幫助。
[0010] 長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的小干擾核糖核酸處理后同時(shí)可下調(diào)2型糖尿 病大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體的表達(dá)，降低糖尿病大鼠血清中細(xì)胞炎性因子一腫瘤壞死因子 (TNF-α)的含量，增加糖尿病大鼠血清中過(guò)氧化氫酶（CAT)和超氧化物歧化酶（S0D)的活 性。因此，長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的小干擾核糖核酸可能通過(guò)減少TNF-a的釋 放、增加超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性、降低2型糖尿病神經(jīng)病理大鼠背根神經(jīng)節(jié) P2X3受體的表達(dá)、抑制背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體介導(dǎo)的傷害性信息傳遞，減輕2型糖尿病神經(jīng) 病理痛大鼠的痛行為。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為2型糖尿病大鼠制模過(guò)程中的機(jī)械縮足反射閾值變化圖。長(zhǎng)非編碼核糖核 酸N0NRATT021972的小干擾RNA處理后對(duì)2型糖尿病大鼠的機(jī)械痛行為具有抑制作用。實(shí) 驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的 小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性（NCsi)對(duì)照組。其中\(zhòng)〈0.05， wp〈0. 01表示和正常組比較，##p〈0. 01表示與糖尿病模型組比較。
[0012] 圖2為2型糖尿病大鼠制模過(guò)程中的熱縮足反射閾值變化圖。長(zhǎng)非編碼核糖核酸 N0NRATT021972的小干擾RNA處理后對(duì)2型糖尿病大鼠的熱敏痛行為具有抑制作用。其中 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972 的小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對(duì)照組。其中\(zhòng)〈0.05， wp〈0. 01表示和正常組比較，##p〈0. 01表示與糖尿病模型組比較。
[0013]圖3為2型糖尿病大鼠制模過(guò)程中的尾神經(jīng)感覺(jué)傳導(dǎo)速度變化圖。長(zhǎng)非編碼核糖 核酸N0NRATT021972的小干擾RNA處理后可改善2型糖尿病大鼠的尾神經(jīng)感覺(jué)傳導(dǎo)速度。 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972 的小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對(duì)照組。其中\(zhòng)〈0.05， wp〈0. 01表示和正常組比較，##p〈0. 01表示與糖尿病模型組比較。
[0014] 圖4為2型糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG)長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的逆 轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)檢測(cè)結(jié)果圖。長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的小干擾 RNA處理后可降低2型糖尿病大鼠DRG上調(diào)的長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972水平。實(shí) 驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的 小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對(duì)照組。圖4 (a)為RT-PCR實(shí) 驗(yàn)結(jié)果圖，圖4(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中#p〈0. 01表示和正常組比較，##p〈0. 01 表示與糖尿病模型組比較。
[0015] 圖5為2型糖尿病大鼠DRG的？2&受體RT-PCR檢測(cè)結(jié)果圖。長(zhǎng)非編碼核糖核酸 N0NRATT021972的小干擾RNA處理后可降低2型糖尿病大鼠DRG上調(diào)的？2乂3受體水平。實(shí) 驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的 小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對(duì)照組。圖5 (a)為RT-PCR實(shí) 驗(yàn)結(jié)果圖，圖5(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中#p〈0. 01表示和正常組比較，##p〈0. 01 表示與糖尿病模型組比較。
[0016] 圖6為2型糖尿病大鼠DRG的？2&受體免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果圖。長(zhǎng)非編碼核糖 核酸N0NRATT021972的小干擾RNA處理后可降低2型糖尿病大鼠DRG上調(diào)的P2X3受體水平。 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972 的小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對(duì)照組。圖6 (a)為免疫組 織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖6 (b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中#p〈0. 01表示和正常組比較， ##p〈0. 01表示與糖尿病模型組比較。
[0017] 圖7為2型糖尿病大鼠DRG的P2X3受體蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果圖。長(zhǎng)非編碼核糖核酸 N0NRATT021972的小干擾RNA處理后可降低2型糖尿病大鼠DRG上調(diào)的？2乂3受體水平。實(shí) 驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972的 小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對(duì)照組。圖7 (a)為蛋白印跡實(shí) 驗(yàn)結(jié)果圖，圖7(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中#p〈0. 01表示和正常組比較，##p〈0. 01 表示與糖尿病模型組比較。
[0018] 圖8為2型糖尿病大鼠血清TNF-α變化檢測(cè)結(jié)果圖。長(zhǎng)非編碼核糖核酸 N0NRATT021972的小干擾RNA處理后可降低2型糖尿病大鼠上調(diào)的血清TNF- a變化水平。 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長(zhǎng)非編碼核糖核酸N0NRATT021972 的小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對(duì)照組。其中wp〈0. 01表 示和正常組比較，##p〈0. 01表示與糖尿病模型組比較。
[0019] 圖9為2型糖尿病大鼠血清過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定