結(jié)果圖。長非編碼核糖核酸 N0NRATT021972的小干擾RNA處理后可增加2型糖尿病大鼠下調(diào)的血清過氧化氫酶（CAT) 活性水平。實驗分組：對照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長非編碼核糖核酸 N0NRATT021972的小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對照組。其 中#p〈0. 01表示和正常組比較，##p〈0. 01表示與糖尿病模型組比較。
[0020] 圖10為2型糖尿病大鼠血清超氧化物歧化酶活性測定結(jié)果圖。長非編碼核糖核 酸N0NRATT021972的小干擾RNA處理后可升增加2型糖尿病大鼠下調(diào)的血清超氧化物歧化 酶（S0D)活性水平。實驗分組：對照組；2型糖尿病模型組；2型糖尿病模型+長非編碼核 糖核酸N0NRATT021972的小干擾RNA處理組；2型糖尿病模型+亂序的小干擾RNA陰性對 照組。其中#P〈〇. 01表示和正常組比較，##P〈〇. 01表示與糖尿病模型組比較。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合實施例并對照附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0022] 實施例1。
[0023] 用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于糖尿病神經(jīng)病理痛治療的口服或注射的長 非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA制劑。
[0024] 實施例2。
[0025] 用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于涉及糖尿病并發(fā)神經(jīng)損傷相關(guān)疾病治療的 口服或注射的長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA制劑。
[0026] 實施例3。
[0027] 用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于涉及糖尿病并發(fā)感覺神經(jīng)炎性相關(guān)疾病治 療的口服或注射的長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾RNA制劑。
[0028] 總之，長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸以口服、注射、含片或其 它局部或全身用藥劑型藥物進(jìn)行上述疾病防治。
[0029] 為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面以長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾 核糖核酸對？2&受體介導(dǎo)的相關(guān)疾病治療作用研究的實驗和結(jié)果來證明長非編碼核糖核 酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸的用途。
[0030] 一、材料和方法。
[0031] 1.動物和分組。
[0032] 健康Sprague-DaWley(SD)大鼠，南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物科學(xué)部提供。健康SD 雄性大鼠60只，體重200g左右，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分成2組，對照組（Ctrl)8只，喂 以基礎(chǔ)飼料；其余大鼠（52只）為糖尿病造模組，喂以高糖高脂飼料（高糖高脂飼料配方： 基礎(chǔ)飼料66. 5%，蔗糖20%，豬油10%，膽固醇2. 5%，膽酸鈉1 %，做成球狀放在恒溫鼓風(fēng) 干燥箱中80°C干烤2天）。第5周末，所有大鼠測體重、空腹血糖和餐后血糖后，造模組大 鼠空腹腹腔注射STZ30mg/kg(STZ溶液的配制：臨用前將STZ溶解于4°C冰箱預(yù)冷的pH為 4. 2的0.lmol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液中，配制成2. 5g/L的STZ溶液），對照組大鼠腹腔 注射相同體積的〇.lmol/L，pH為4. 2檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。第6周末測血糖，空腹血 糖<7. 8mmol/L且餐后血糖< 11.lmmol/L的造模組大鼠再次給予空腹腹腔注射STZ30mg/ kg。第7周末測血糖，空腹血糖大于7. 8mmol/L，或餐后血糖> 11.lmmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)。
[0033] 長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小RNA干擾（siRNA)序列由 Invitrogen(Carlsbad,CA)公司提供，靶序列為 5' -GAATGTTGGTCATATCAAA-3'；陰性對 照scrambledsiRNA(CNsi)購至Invitrogen(Carlsbad,CA)公司。在體轉(zhuǎn)染試劑由 Entranster?公司提供。根據(jù)Entranster?在體轉(zhuǎn)染說明書，實驗第7周末對糖尿病造模 成功的大鼠進(jìn)行長非編碼核糖核酸N0NRATT021972-siRNA在體小干擾實驗。
[0034] 在第7周末將糖尿病造模成模的大鼠隨機分成3組，S卩：糖尿病模型+生理鹽水 組（DM+NS)，糖尿病模型+長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸（siRNA)處 理組（DM+長非編碼核糖核酸N0NRATT021972si)，糖尿病模型+scrambledsiRNA(亂序小 干擾核糖核酸）陰性對照（negativecontrolsiRNA，NCsi)組（DM+NCsi)。DM+長非編碼 核糖核酸N0NRATT021972si和DM+NCsi的大鼠分別給予舌下靜脈注射長非編碼核糖核酸 N0NRATT021972siRNA和NCsiRNA。前期的Ctrl和DM組舌下靜脈注射生理鹽水，分別成為 生理鹽水對照組（Ctrl+NS)和糖尿病模型+生理鹽水組（DM+NS)。1周后測血糖后取材（背 根神經(jīng)節(jié)）。
[0035] 2.藥物與試劑。
[0036]鏈脲佐菌素（Sigma公司），動物體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑（Entranster?-invivo)、兔源性噪 呤 2X3(P2X3)抗體（Abeam公司）。
[0037] 3.主要儀器。
[0038] 羅康全活力型血糖儀（德國羅氏公司）；消毒紗布、手巾、棉簽等，碘酒及75%酒 精，手術(shù)器械包：剪刀、眼科小彎鑷、血管鉗、絲線、有齒鑷等。
[0039] 4.體重測定。
[0040] 分別于第1，5,7,8周末測量各組大鼠體重，每次測量的時間及其他條件保持一 致。
[0041] 5.血糖的測定。
[0042] 分別于第1，5,7,8周末測量各組大鼠空腹血糖和餐后血糖，每次測量的時間及其 他條件保持一致。測血糖時，先將大鼠固定，用酒精棉球擦拭大鼠尾巴，然后用消毒剪刀剪 去尾尖2-3cm，將尾巴上的血直接滴在已準(zhǔn)備好的安裝在血糖儀上的血糖試紙上。采血結(jié)束 后，用碘伏消毒大鼠尾巴傷口。
[0043] 6.大鼠行為學(xué)測定。
[0044] 分別于第1，5,7,8周末測量各組大鼠機械縮足反射閾值（MWT)和熱縮足反射潛伏 期（TWL)，每次測量的時間及其他條件保持一致。
[0045] (1)機械縮足反射閾值的檢測：采用的裝置為VonFrey細(xì)絲。將大鼠置于長寬高 為20cmX10cmX30cm的透明有機玻璃盒中，并放在鐵絲網(wǎng)上，此裝置高于實驗臺，以便能 夠清楚地觀察大鼠足底，適應(yīng)半個小時后進(jìn)行檢測。VonFrey的折力分別為0.008、0. 02、 0· 04、0· 07、0· 16、0· 4、0· 6、1· 0、1· 4、2· 0、4· 0、6· 0、8· 0、10· 0、15· 0、26· 0。用細(xì)絲刺激大鼠 右足底，每只大鼠每個力度試驗10次，相鄰兩次測試的間隔時間至少為30秒，刺激引起的 反應(yīng)（如舔足、甩腿等）完全消失后才可以進(jìn)行下次試驗。測量時從最小力度開始，直到某 個力度刺激大鼠引起反應(yīng)的次數(shù)大于5次時，記下此力度，即為機械縮足反射閾值。大于 26. 0g時記為 26. 0g。
[0046] (2)熱痛敏縮足反射閾值的檢測：本測試采用的儀器是BME-410C型全自動熱痛刺 激儀。將與上述相同的玻璃盒放在3mm厚的玻璃板上，大鼠置于玻璃盒中，待適應(yīng)30分鐘 后進(jìn)行測試。采用熱輻射照射大鼠右足底，記錄從照射到出現(xiàn)抬腿的時間，即TWL。為防止 組織損傷，切斷時間為30s。
[0047]7、大鼠尾神經(jīng)感覺傳導(dǎo)速度的測定。
[0048] 分別于第1，5,7,8周末測量各組大鼠尾神經(jīng)感覺傳導(dǎo)速度。測定前用10%水合氯 醛300mg/kg腹腔注射麻醉，俯臥固定，順向法測定尾神經(jīng)感覺傳導(dǎo)速度。刺激環(huán)狀電極位 于尾巴遠(yuǎn)端，刺激電極陰極（黑色）置于尾神經(jīng)近端、陽極電極（紅色）置于遠(yuǎn)端，兩者相距 lcm;記錄環(huán)形電極位于刺激點近端10cm處。接地電極置于刺激電極與記錄電極之間，刺激 強度固定為1.2mA。感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度（m/s)=記錄電極與刺激電極間距離（10cm)X10/ 潛伏期（ms)，波幅測定取峰-峰值。統(tǒng)計分析比較各組結(jié)果。
[0049] 8、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)。
[0050] (1)提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA:所有器械均經(jīng)DEPC處理。在第8周末取材，分 別取各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)，用DEPC處理過的PBS沖洗，置于RNAStore液中-20°C保存， 提取RNA時將神經(jīng)節(jié)取出移至加有l(wèi)mlTrizol勻漿器中，研磨后轉(zhuǎn)移到1. 5ml的無核酶 離心管中，加入0. 2ml氯仿，劇烈震蕩15s，靜置3min,，低溫離心12000gX15min,收集上 層無色液相，加入與液相等體積的異丙醇，混勻，常溫靜置25min，沉淀RNA，之后4°C離心 12000gXlOmin，棄上清，在管底可見少許白色沉淀為RNA，加入lml無核酶水配置的75%乙 醇，充分洗滌RNA。4°C離心5000gX3min后，吸棄上清液，倒置2分鐘，略干燥（切勿過分干 燥，否則RNA不溶于水），加20μ1無RNase水溶解沉淀。采用50μ1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：無核 酶水11.75卩1，5父1311打6『10卩1，(1犯133卩1，0118〇丁2卩1，111^2卩1，1?仙81111.25卩1， RNA樣本20μ1，共50μ1，離心，恒溫37°C水浴1小時。
[0051] (2)設(shè)計引物：參考文獻(xiàn)設(shè)計長非編碼核糖核酸N0NRATT021972和？2乂3受體引物 序列。本發(fā)明選用β-actin作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，引物序列分別為：
[0053] (3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系（共30μ1):
[0054]
[0055] (4)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)條件：
[0056]
[0057] (5)瓊脂糖凝膠電泳：制備1. 5 %瓊脂糖凝膠，用移液槍取PCR產(chǎn)物按10μL/孔進(jìn) 行上樣，電泳緩沖液為1XTAE，電壓100V，電流300mA，電泳時間40min，采用凝膠成像系統(tǒng) 拍照，分析數(shù)據(jù)。用β-actin作為內(nèi)參對長非編碼核糖核酸N0NRATT021972和？2&受體 的密度進(jìn)行標(biāo)化。
[0058] 9、免疫組織化學(xué)方法。
[0059] (1)提取組織：取各組大鼠01?，預(yù)冷的？85清洗，4%??4固定4811后30%蔗糖脫 水，切片，其厚度為7μm，切片-20°C保存。
[0060] (2)免疫組化：