>[0061] 1)切片取出恢復室溫后0· 01MPBS洗3次，每次5min;
[0062] 2) 3 % 的H202作用 5min;
[0063] 3)PBS洗 3 次，每次 5min;
[0064] 4) 5 %BSA液中 37°C孵育lh;
[0065] 5)棄去5%BSA液，轉(zhuǎn)入稀釋好的一抗（P2Xjjt體為兔來源，稀釋比例為1:100)里 4°C過夜；
[0066] 6)次日，恢復室溫半小時后經(jīng)PBS常規(guī)沖洗后放入生物素標記的二抗37°C水浴孵 育 45min;
[0067] 7)PBS沖洗后轉(zhuǎn)入SABC液室溫30min;
[0068] 8)PBS沖洗后顯微鏡下DAB顯色2min，放入PBS中以終止顯色反應，，經(jīng)梯度酒精 脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。顯微鏡下拍照。
[0069] (3)用Image圖像分析系統(tǒng)觀察分析反應密度。比較各組免疫化學反應結(jié)果。
[0070] 10、免疫熒光雙標。
[0071] (1)提取組織：取各組大鼠01?，預冷的？85清洗，4%??4固定4811后30%蔗糖脫 水，切片，其厚度為7μm，切片-20°C保存。
[0072] (2)免疫熒光：
[0073] 1)切片取出恢復室溫后(λ01MPBS洗3次，每次5min，
[0074] 2)3%TritonX-100 作用 15min;
[0075] 3)PBS洗 3 次，每次 5min;
[0076] 4) 10%山羊血清37°C封閉lh;
[0077] 5)棄去山羊血清封閉液，加入稀釋好的雙標一抗（P2XA兔來源，稀釋比例為 1:100)，4°C冰箱過夜；
[0078] 6)次日，恢復室溫半小時后，經(jīng)PBS常規(guī)沖洗后放入帶有熒光標記的二抗（山羊抗 兔FITC:1:200，山羊抗小鼠TRITC:1:200) 37°C水浴 45min，避光；
[0079] 7)PBS避光沖洗后，熒光封片劑封片；
[0080] 8)熒光顯微鏡下拍照，分析結(jié)果。
[0081] 11、蛋白印跡。
[0082] (1)蛋白提?。簩RG置于加有200μ1組織裂解液（含PMSF)的1ml勻漿器中， 于冰上研磨充分。反復裂解后，將勻漿樣品轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管中，4°C，12000g離心lOmin， 取上清，按比例加入5Xloadingbuffer和DTT，混勻后煮沸5min，使蛋白變性，-20°C保存， 備用。
[0083] (2)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳：
[0084] 制備SDS-PAGE凝膠，所用試劑如下表：
[0085] 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳構(gòu)成（ml)
[0088](3)上樣及電泳：每孔上樣量為25μ1(蛋白含量約為20yg)，樣本兩邊加2μ1 蛋白Marker。濃縮膠恒壓90V(約45min)，分離膠120V，待溴酸藍迀移至膠的下緣時（約 90min)停止電泳。
[0089] (4)轉(zhuǎn)膜：根據(jù)蛋白Marker的指示和目的蛋白的分子量準備合適大小的PVDF膜 和2張4層的濾紙，PVDF膜浸入甲醇作用5min后，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中（濾紙置于轉(zhuǎn)膜緩沖 液中）浸泡以備用。電泳完畢后轉(zhuǎn)膜，300mA轉(zhuǎn)膜1個小時。
[0090] (5)免疫反應：
[0091]A)封閉：將膜置于含5 %BSA的TBST封閉液中，水平搖床室溫作用2h。
[0092]B) -抗結(jié)合：將膜放入用5%BSA配制的一抗（兔來源的P2X3#釋比例1:1000， 小鼠抗β-actin單抗稀釋比例1:800)中，4°C過夜，或室溫平搖3h，TBST洗膜3次。
[0093] C)二抗結(jié)合：將膜用IgG-HRP二抗反應液（P2X3:抗為山羊抗兔，按1:2000溶于 封閉液，β-actin為山羊抗小鼠，按1 :5000溶于封閉液）孵育，室溫平搖1. 5h后，TBST洗 膜10minX4次。
[0094]D)、免疫復合物的檢測：膜加ECL發(fā)光劑反應3min后，用保鮮膜包裹，置于X線暗 盒，暗室中剪大小合適X線膠片，曝光l〇s~lOmin，顯影、定影，
[0095](7)半定量分析：膠片掃描后，通過Image圖像分析軟件分析目的條帶在的光密度 值，以各組β-actin條帶的光密度值標化其相應組P2Xj^蛋白表達量。
[0096] 12、酶聯(lián)免疫吸附劑測定（Elisa)測定血清TNFa水平。
[0097] (1)血清準備：在第8周末，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，仰臥位固定經(jīng)頸動 脈取血，離心管收集血液后室溫靜置30min，3000g離心lOmin，取上清（即血清），分裝 后-20 °C保存；
[0098] (2)檢測前20分鐘從冰箱取出試劑盒和血清，平衡至室溫。并取出所需的板條，剩 余的板條密封后放于4°C保存；
[0099] (3)標準曲線的建立：設立8個標準孔，每孔設立3個復孔作為取平均值。每孔中 加入試劑盒中的樣品稀釋液100y1，之后弟一孔加入標準品100μ1，混勾后取出100y1加 入到第二個孔中，如此反復對半稀釋到第7孔，混勻后，從第7孔中吸取100μ1棄去，每孔 體積均為100μ1，第8個孔為空白對照；
[0100] (4)加樣：在剩下的干凈板條孔中加入待測血清100μ1，并設立3個復孔作為對 昭. ，
[0101] (5)反應板置于37°C反應120min;
[0102] (6)洗板：用試劑盒中的洗滌液充分洗滌反應板4-6次，最后在濾紙上印干液體。
[0103] (7)在每孔中加入100μ1第一抗體工作液；
[0104] (8)反應板充分混勻后置于37°C作用60min;
[0105] (9)洗板：用試劑盒中的洗滌液充分洗滌反應板4-6次，最后在濾紙上印干液體；
[0106] (10)在每孔中加入100μ1酶標抗體工作液；
[0107] (11)反應板充分混勻后置于37°C作用60min;
[0108](12)洗板：同上；
[0109] (13)在每孔中加入100μ1底物液，置于37°C避光作用lOmin;
[0110] (14)在每孔中加入150μ1終止液混勻；
[0111] (15)測 450nm處吸光度。
[0112] 13、氧化應激水平測定。
[0113] 13. 1、過氧化氫酶（CAT)活性測定。
[0114]CAT分解H202的反應可以通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的Η202與鉬酸銨作用 可以生成一種淡黃色的絡合物，于405nm處測定其生成量，可以計算出CAT的活力，以每毫 升血清每秒鐘分解的1μmol的H202的量為一個活力單位。由南京建成公司提供的CAT試 劑盒中包含以下試劑：
[0115] 試劑一：液體100ml1瓶，4°C保存；
[0116] 試劑二：底物液體10ml1瓶，4°C保存；
[0117] 試劑三：顯色粉劑1瓶，臨用前加雙蒸水至100ml溶解，4°C保存；
[0118] 試劑四：液體10ml1瓶，4 °C保存。
[0119]操作步驟如下：
[0120]
[0121] CAT活力計算公式為：
[0122]
[0123] 13. 2、超氧化物歧化酶（SOD)活性測定。
[0124] 通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)生成超氧陰離子自由基（02 ·)，后者氧化羥 胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色，測定其吸光度。當被檢樣品中含有S0D時， 其對超氧陰離子自由基有專一的抑制作用，使其形成的亞硝酸鹽減少。通過公式可計算求 出被檢樣品的S0D活力。由南京建成公司提供的S0D試劑盒中包含以下試劑：
[0125] 試劑一 備液10ml1瓶，用時加雙蒸水稀釋到100ml，4°C保存；
[0126] 試劑二：液體10ml1瓶，4°C保存；
[0127] 試劑三：液體10ml1瓶，4°C保存；
[0128] 試劑四：液體350μ1X2支，4°C保存；4號稀釋液10ml1瓶，用時二者按1:14稀 釋；
[0129] 試劑五：粉劑1支，用時加70_80°C雙蒸水75ml溶解備用；
[0130] 實際六：粉劑1支，用時加雙蒸水75ml溶解備用；
[0131] 顯色劑的配制：按試劑五：試劑六：冰乙酸=3:3:2的體積比配顯色劑。
[0132] 操作步驟如下：
[0133]
[0134] SOD活力計算公式為：
[0135]
[0136] 14、統(tǒng)計學方法。
[0137] 應用SPSS統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果以均數(shù)土標準差（^ 表示，各 組之間差異性采用方差分析，組間比較采用LSD法，ρ〈0. 05表示有顯著性差異，ρ〈0. 01為極 顯著差異。
[0138]二、結(jié)果。
[0139](一）行為學結(jié)果。
[0140] 各組大鼠造模中均未見肢體運動障礙和自殘現(xiàn)象。造模前測定各組間機械縮足反 射閾值及熱縮足反射潛伏期的基礎值差異無顯著性（Ρ>〇. 05,F3,2S= 2. 15)。
[0141] 1、機械痛敏（MWT)測定結(jié)果。
[0142] 在給予糖尿病飲食4周后，糖尿病模型大鼠的機械縮足反射閾值開始降低，但與 對照組相比其降低無統(tǒng)計學意義（P>〇. 05,F3,2S= 2. 67);給予STZ腹腔注射后2周，糖尿 病模型大鼠的機械縮足反射閾值明顯降低，與對照組相比具有顯著性差異（P〈〇. 01，F(xiàn)3i2S= 21. 87);糖尿病模型大鼠給予長非編碼核糖核酸N0NRATT021972小干擾核糖核酸處理后， 機械縮足反射閾值明顯增加，與對照相比其差異無統(tǒng)計學意義（P>〇. 〇5，F(xiàn)M4= 1. 67)，而與 糖尿病模型組相比有顯著性差異（?〈〇.〇1，匕14= 13.54);而模型+亂序小干擾處理組的與 對照組之間相比有顯著性差異（P〈〇. 〇1，匕14= 15. 36)，但與糖尿病模型組相比其差異無統(tǒng) 計學意義（Ρ>〇· 05,Flil4= 2. 96)(見圖 1)。
[0143] 2、熱痛敏（TWL)測定結(jié)果。
[0144] 在給予糖尿病飲食4周后，糖尿病模型大鼠的熱縮足反射閾值開始降低