用于藥物遞送的修飾的聚(β-氨基酯)的制作方法
【專利說明】用于藥物遞送的修飾的聚（β-氨基酯）
[0001] 本發(fā)明涉及適于用于活性劑的遞送的聚合物。本發(fā)明還涉及包含這些聚合物的納 米顆粒和它們的制備方法。
[0002] 缺乏遞送多核苷酸如DNA和RNA的安全和有效率的載體仍是基因治療成 功的主要障礙（Luo，D.&Saltzman，W.M.SyntheticDNAdiliverysystems.Nature Biotech. 18,33-37(2000)；KamimuraK.等人，AdvancesinGeneDeliverySystems. Pharmaceut.Med.25,293-306(2011);MieleE.等人，Nanoparticle-baseddeliveryof smallinterferingRNAchallengesforcancertherapy.Int.J.Nanomedicine7， 3637-3657(2012))。大多數(shù)用于多核苷酸遞送的方案使用病毒載體，其是高度有效率的遞 送系統(tǒng)。然而，病毒載體具有某些劣勢，包括安全風險、有限的攜帶多核苷酸的容量和大規(guī) 模生產(chǎn)的高成本。非病毒載體提供潛在的優(yōu)勢，包括高包裝容量、容易生產(chǎn)、低毒性和免疫 原性，但沒有病毒載體有效率（Mintzer，M.A.&Simanek，E.E.Nonviralvectorsforgene delivery.Chem.Rev. 109,259-302(2009))〇
[0003] 已經(jīng)描述了可生物降解的聚（β-氨基酯）（PBAE)作為潛在的非病毒多核苷酸 遞送載體，其能夠?qū)NA和RNA二者濃縮在分離的納米顆粒中（Green，J.J.等人Acc. ChemRes. 41,749-759(2008))。用伯胺在PBAE的末端進行化學修飾（參見方案1)已經(jīng) 顯示產(chǎn)生比商用轉(zhuǎn)染劑如Lipofectamine2000,Fugene和聚乙稀亞胺（PEI)高的轉(zhuǎn)染效 率（Zugates，G.T.等人BioconjugateChem. 18,1887-1896 (2007) ;Green，J.J.等人Nano letters8,3126-3130(2008) ;W002/31025A2)。
[0005] 持續(xù)需要改善的無毒、可生物降解的、生物相容的、可以用于有效轉(zhuǎn)染多核苷酸 的、并且可以經(jīng)濟地制備的聚合物。這樣的聚合物將用于在基因治療中包裝和遞送DNA和 RNA和用于包裝和遞送其它診斷、治療和預防試劑。
[0006] 尤其是，存在對可以用于有效轉(zhuǎn)染在循環(huán)中具有差的穩(wěn)定性的短多核苷酸，特別 是siRNA和microRNA(miRNA)的聚合物的需求。已有的聚合多核苷酸遞送載體不能以高載 量包封siRNA和miRNA，原因是這些序列長度較短。此外，很多已有的用于siRNA和miRNA 的聚合遞送載體有細胞毒性。
[0007] 本發(fā)明提供新型的末端修飾的PBAE，其可用于多種醫(yī)藥應用，包括藥物遞送，特別 是用于遞送多核苷酸；組織改造和生物材料。本發(fā)明特別涉及PBAE的醫(yī)藥應用。本發(fā)明還 提供本發(fā)明的末端修飾的聚合物與多核苷酸的復合物，包括本發(fā)明的聚合物的藥物遞送裝 置（例如，微粒，納米顆粒），制備末端修飾的聚合物的方法，和使用本發(fā)明的末端修飾的聚 合物的方法。
[0008] 這些系統(tǒng)的聚酯性質(zhì)由于其高的可生物降解性和降低的毒性，導致引人注目的生 物相容屬性。因此，這些聚合物作為非病毒多核苷酸遞送載體在很多疾病如癌癥、單成因疾 ?。╩onogeneticdiseases)、血管疾病和感染性疾病的治療中具有應用。這些多核苷酸遞 送載體的另一種應用是在體外研究中作為工具以研究基因功能或細胞和生理背景下的調(diào) To
[0009] 在第一個方面，本發(fā)明提供式I的聚合物：
[0011] 其中[0012] LdPL2獨立地選自由以下各項組成的組：
[0013] 〇、S、NRx 和鍵；其中RJ蟲 'S： 立地選自由以下各項組成的組：氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜烷基、雜環(huán)烷基、酰 基、芳基或雜芳基；
[0014] L3獨立地選自由以下各項組成的組：亞烷基、亞烯基、雜亞烷基、雜亞烯基、亞芳基 或雜亞芳基；
[0015] L4獨立地選自由以下各項組成的組：
[0016]
[0017] L5獨立地選自由以下各項組成的組：亞烷基、亞烯基、雜亞烷基、雜亞烯基、亞芳基 或雜亞芳基；
[0018] 札和R2獨立地選自寡肽和Ry;
[0019] 其中札和1?2中的至少一個是寡肽；
[0020] 并且其中&選自由以下各項組成的組：氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜烷 基、雜環(huán)烷基、?；?，芳基或雜芳基；
[0021] 各個私獨立地選自由以下各項組成的組：氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜 烷基、雜環(huán)烷基、酰基、芳基或雜芳基；和
[0022] η是5至10, 000的整數(shù)；
[0023] 或其藥用鹽。
[0024] 在第二個方面，本發(fā)明提供式I的聚合物，其中
[0025]LdPL2獨立地選自由以下各項組成的組：
[0026]
0、S、NRX和鍵；其中RJ蟲
立地選自由以下各項組成的組：氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜烷基、雜環(huán)烷基、酰 基、芳基或雜芳基；
[0027]L3的至少一次出現(xiàn)是
[0028] 其中1\是
并且T2選自H、烷基或
[0029]
[0030] 其中LT獨立地選自由以下各項組成的組：
[0031] 〇、3、冊：(和鍵；其中1^獨 、. 立地選自由以下各項組成的組：氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜烷基、雜環(huán)烷基、酰 基、芳基或雜芳基；
[0032] 其余的1^基團在每次出現(xiàn)時獨立地選自由以下各項組成的組：亞烷基、亞烯基、雜 亞烷基、雜亞烯基、亞芳基或雜亞芳基，其中
[0033]L4獨立地選自由以下各項組成的組：
[0034]
[0035] L5獨立地選自由以下各項組成的組：亞烷基，亞烯基，雜亞烷基，雜亞烯基，亞芳基 或雜亞芳基；
[0036] &、私和Rτ獨立地選自寡肽和Ry;
[0037] 其中&、私和RT中的至少一個是寡肽；
[0038] 并且其中&選自由以下各項組成的組：氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜烷 基、雜環(huán)烷基、?；?、芳基或雜芳基；
[0039] 各個私獨立地選自由以下各項組成的組：氫、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烯基、環(huán)烯基、雜 烷基、雜環(huán)烷基、?；?、芳基或雜芳基；并且
[0040] η是5至10, 000的整數(shù)；
[0041] 或其藥用鹽。
[0042] 本發(fā)明因此提供末端被至少一種寡肽修飾的ΡΒΑΕ。這些ΡΒΑΕ用作多核苷酸的優(yōu) 良的濃縮劑和/或用作靶向配體以增強細胞攝取和轉(zhuǎn)染效率。這些聚合物具有能夠改善多 核苷酸向細胞的遞送的可生物降解的基團并且與已知的ΡΒΑΕ和商用轉(zhuǎn)染劑相比在體外顯 示出高的轉(zhuǎn)染效率和降低的細胞毒性。
[0043] 式I的聚合物可以通過將式II的二丙烯酸酯單體與式L4H2的取代的胺反應以形 成丙烯酸酯封端的中間體式ΠΙ來制備。
[0044]
[0045] 隨后，可以通過與末端丙烯酸酯基團的反應來添加基團RA和R2L2以形成式I的 聚合物。
[0046]
[0047] 在根據(jù)本發(fā)明的聚合物中，選擇各個LJPL2 (并且，在第二個方面中，LT)以促進末 端修飾基團&和1?2與PBAE聚合物的偶聯(lián)。例如在末端修飾基團是包含末端半胱氨酸殘基 的寡肽的情況下，各個LdPL2 (并且，在第二個方面，LT)可以是鍵。
[0048] 在本發(fā)明的第二個方面中，選擇LT以促進末端修飾基團1^與PBAE聚合物的偶聯(lián)。 例如在末端修飾基團是包含末端半胱氨酸殘基的寡肽的情況下，LT可以是鍵。
[0049] 在根據(jù)本發(fā)明的聚合物中，Rx可以獨立地選自由以下各項組成的組：氫、烷基、環(huán) 烷基、烯基、環(huán)烯基、雜烷基和雜環(huán)烷基，例如，選自由以下各項組成的組：氣、烷基和環(huán)燒 基。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明，"寡肽"包括通過肽鍵連接在一起的至少三個氨基酸的鏈。這種肽 優(yōu)選僅包含天然氨基酸，但是可以備選地使用本領域已知的非天然氨基酸（即，不天然存 在但可以并入多肽鏈中的化合物）和/或氨基酸類似物。此外，這種肽中的一個以上氨基 酸可以例如，通過添加化學實體如碳水化合物基團、磷酸基、法呢基（farnesyl)、異法呢基 (isofarnesyl)、脂肪酸基、或用于綴合、官能化、或其它修飾的接頭等來修飾。本發(fā)明的聚 合物中的寡肽通常包含3至20個氨基酸殘基，更優(yōu)選3至10個氨基酸殘基，更優(yōu)選3至6 個氨基酸殘基。備選地，本發(fā)明的聚合物中的寡肽可以包含4至20個氨基酸殘基，更優(yōu)選 4至10個氨基酸殘基，更優(yōu)選4至6個氨基酸殘基。
[0051] 本發(fā)明還提供式I的聚合物，其中所述寡肽或各個寡肽在PH7具有凈正電荷。所 述寡肽或各個寡肽可以包含在PH7帶正電的天然存在的氨基酸，S卩，賴氨酸、精氨酸和組氨 酸。例如，所述或各個寡肽可以選自由以下各項組成的組：聚賴氨酸，聚精氨酸或聚組氨酸， 其各自可以以半胱氨酸封端。
[0052] 在一個實施方案中，所述或各個寡肽優(yōu)選為式IV的化合物：
[0053]
[0054] 其中p是2至19,通常3至9或3至5的整數(shù)，并且其中Ra在每次出現(xiàn)時選自由 以下各項組成的組：H2NC( =NH)-NH(CH2)3 -、H2N(CH2)4 -或（1H-咪唑-4-基）-CH2-。
[0055] 在所述寡肽或各個寡肽是式IV的化合物的情況下，將所述寡肽或各個寡肽與所 述聚合物連接的LdP/或L2 (和/或，在第二個方面，LT)是鍵并且末端半胱氨酸殘基提供 將所述寡肽或各個寡肽與丙烯酸酯封端的中間體式III偶聯(lián)的方式。硫醇官能度提供更 快、更有效且更容易控制的到雙鍵的添加。相反，在所述寡肽或各個寡肽終止于胺官能度以 用于偶聯(lián)時，在偶聯(lián)步驟中需要過量的這種化合物。
[0056] 本發(fā)明還提供式I的聚合物，其中所述寡肽或各個寡肽在pH7具有凈負電荷。所 述寡肽或各個寡肽可以包含在PH7帶負電的天然存在的氨基酸，S卩，天冬氨酸和谷氨酸。例 如，所述或各個寡肽可以選自由以下各項組成的組：聚天冬氨酸和聚谷氨酸，其各自可以以 半胱氨酸封端。在該實施方案中，所述寡肽或各個寡肽可以是式IV的化合物，其中p是2 至19,通常3至9或3至5的整數(shù)，并且其中艮是HO2C(CH2)2 -或H02C-CH2 -。在該情況 下，將所述寡肽或各個寡肽與所述聚合物連接的LdP/或L2是鍵，同時末端半胱氨酸殘基 提供將所述寡肽或各個寡肽與丙烯酸酯封端的中間體式IV偶聯(lián)的方式。
[0057] 備選地，所述或各個寡肽可以包含在pH7帶負電的天然存在的氨基酸和在pH7帶 正電的天然存在的氨基酸的混合物。
[0058] 本發(fā)明還提供式I的聚合物，其中所述寡肽或各個寡肽是疏水的。所述寡肽或各 個寡肽可以包含疏水的天然存在的氨基酸如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和丙氨酸；尤其是，所述或各個寡肽可以包含纈氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。
[0059] 本發(fā)明還提供式I的聚合物，其中所述寡肽或各個寡肽是親水的。所述寡肽或各 個寡肽可以包含親水的天然存在的氨基酸，如絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨 酰胺，并且還可以包含在PH7帶電的天然存在的氨基酸。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供式I的聚合物，其中&和R2二者都是寡肽，并且提 供式I的聚合物，其中&和R2中的一個是寡肽并且R:和R2中的一個是Ry。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，當札和R2中的一個是1時，則Ry優(yōu)選選自由以下各項 組成的組：氫、-(CH丄NH2、- (CH2)^ΝΗΜθ、- (CH丄0H、- (CH2)"013、- (CH2) 2 (0CH2CH2)"順2、- (CH2) dOCHfHiOH和-(CHKOa^CHia^，其中m是1至20,例如1至5的整數(shù)。優(yōu)選地，心選 自由以下各項組成的組^(CH^NHy-(CH^NHMe和-(0^(0(??)^?。優(yōu)選地，當1^是 NH或NRX，并且札和R2中的一個是R對，則Ry不同于R3。
[0062] 本發(fā)明的