裝有兩 個(gè)GPCUltrastyragel柱，103 和丨,〇]A(5ym混合的，300mmX19mm，WatersMillipore Corporation，Milford，MA，USA)并且以THF為流動(dòng)相的Hewlett-Packard1050Series HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行分子量確定。通過(guò)與聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間比較來(lái)計(jì)算分子量。
[0192] 實(shí)施例2 :丙燔酸醅封端的中間體的合成
[0193] 將 1,4-丁二醇二丙烯酸酯（8. 96g，4. 07X10 2mol)和 5-氨基-1-戊醇（3. 5g， 3. 39X10 2mol)在小瓶中混合。將混合物在90°C攪拌24h，并且隨后冷卻至室溫，形成淺黃 色粘性固體，丙烯酸酯封端的中間體（指定為C32)。將中間體C32儲(chǔ)存在4°C，隨后用于之 后的步驟。
[0194]
[0195] 實(shí)施例3(比較例）：用伯胺講行末端修飾的PBAE的合成
[0196] 用伯胺進(jìn)行末端修飾的PBAE如Zugates，G.T.等人·BioconjugateChem. 18， 1887-1896(2007)中定義的制備。將中間體C32(lg，0.5mmol)在THF(2ml)中的溶液與 1，5_二氨基-2-甲基-戊烷（0.24g，0.271ml，2mmol)在THF(8ml)中的溶液混合。將混合 物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，隨后在二乙醚（100ml)中沉淀并最后在真空中干燥。
[0197]
[0198] 實(shí)施例4 (比較例）：用伯胺講行末端修飾的PBAE的講一步合成
[0199] 按照在其它地方（Zugates，G.T.等人·Bioconj.Chem. 181887 - 1896 (2007)， Yang，F(xiàn).等人，Proc.NatlAcad.Sci.USA. 1073317 - 3322 (2010)，Sunshine， J.C.BiomacroMolecules123592 - 3600 (2011))中描述的方法合成二胺末端修飾的聚 (β-氨基酯），B3。簡(jiǎn)言之，將5-氨基-1-戊醇（3.44g，33mmol)和1，4_ 丁二醇二丙烯酸 酯（7.93g，40mmol)在磁性攪拌下在90°C聚合24小時(shí)。將得到的丙烯酸酯-封端的聚合物 C32(lg，0. 4mmol)和2-甲基-1,5-戊二胺（0. 23g，0. 27mL，2mmol)溶解在四氫呋喃中并且 在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。通過(guò)在二乙醚中沉淀將得到的二胺末端修飾的聚合物B3分離并且在真 空下干燥。
[0200] IR(蒸發(fā)膜（evaporatedfilm) :v= 1055, 1089, 1125, 1196(00)，1257, 1463, 1 733(C= 0)，2079, 2191，2253, 2861，2936, 3398 (N-H, 0-H)cm1
[0201] ^-NMR(400MHz,CD30D,TMS) (ppm) :δ= 4. 11 (t,CH2-CH2-〇), 3. 72 (t), 3, 55 (t,CH2 -C^-OH), 2. 87 (t, -NH-CH2-CH2-C( = 0) -), 2. 77 (t,CH^C^-N-), 2. 60-2. 51 (br, -NH-CH2-(CH 2)2-CH(CH3) -NH-), 2. 46 (br, >N-CH2- (CH2) 4-〇H, >N-CH2-CH2-C( = 0) -〇), 1. 87 (br) ,1-73 (br), 1. 60-1. 41 (br, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-0, -CH2-CH2-0H, -CH2-CH2-NH2), 1. 35 (br, -N-CH2-CH2-CH2 -(CH2) 2-0H)，0· 94 (d,CH3-CH〈自二胺）。
[0202] 實(shí)施例5 :末端用寡肽修飾的PBAE的合成
[0203] 通常，如下獲得寡肽修飾的PBAE:將丙烯酸酯-封端的聚合物C32或C32SS和 胺-或硫醇-封端的寡肽（例如，HS-Cys-Arg-Arg-Arg(CR3)，H2N-Arg-Arg-Arg(R3)或 HS-Cys-Glu-Glu-Glu(CE3)-其它寡肽通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)單字母編碼的相似縮寫(xiě)表明）以1:2 的摩爾比在DMS0中混合。將混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜并且通過(guò)在二乙醚：丙酮（3:1)中沉 淀獲得產(chǎn)生的聚合物。
[0204] (a)以下用于獲得三精氨酸末端修飾的PBAE的合成步驟作為實(shí)例顯示：中間體 C32如以上實(shí)施例1中所述制備。將中間體C32(0. 15g，0. 075mmol)在DMS0(2ml)中的溶液 與寡肽（Cys-Arg-Arg_Arg(CR3 ;0.llg，0. 15mmol)在DMSO(lmL)中的相應(yīng)溶液以適當(dāng)摩爾 比，1:2分別混合。將混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，然后在二乙醚/丙酮（3:1)中沉淀。
[0205]
[0206] IR(蒸發(fā)膜）：v= 721，801，834, 951，1029, 1133(00)，1201，1421，1466, 1542, 1 672(C= 0，自肽酰胺），1731(C= 0，自酯），2858, 2941，3182, 3343(N-H, 〇-H)cm1
[0207] 蟲(chóng)-匪!?（400MHz,CD30D,TMS) (ppm) :δ= 4. 41-4. 33 (br,NH2-C( = 0) -CH-NH-C(= 0) -CH-NH-C( = 0) -CH-NH-C( = 0) -CH-CH2-, 4. 11 (t,CH2-CH2-〇),3. 55 (t,CH^C^-OH),3. 22 (br,NH2-C( =NH) -NH-CH2-，〇H- (CH2) 4-CH2-N_),3. 04 (t,CH2-CH2-N-),2. 82 (dd, -CH2-S-CH2)， 2. 48 (br，-N-CH2-CH2-C( = 0) -0)，1. 90 (m，NH2-C( =NH) -NH- (CH2) 2-CH2-CH-)，1. 73 (br，-0-C H2-CH2-CH2-CH2-0)，1. 69 (m，NH2-C( =NH) -NH-CH2-CH2-CH2-)，1. 56 (br，-CH2-CH2-CH2-CH2-0H) ,L39 (br, -N- (CH2) 2-CH2- (CH2) 2-〇H)〇
[0208] (b)三賴(lài)氨酸修飾的寡肽（K3C-C32-CK3)根據(jù)相同方案制備并且表征如下：
[0209] IR(蒸發(fā)膜）：v= 721，799, 834, 1040, 1132, 1179(00)，1201，1397, 1459, 1541， 1675(C= 0,frompeptideamide),1732(C= 0,fromester),2861, 2940, 3348(N-H, 〇-H) cm1
[0210] iH-NMRGOOMHz,CD30D,TMS) (ppm) :δ= 4. 38-4. 29 (br,NH2-(CH2)4-CH_)，4. 13 (t, CH2-CH2-0-)，3. 73 (br，NH2-CH_CH2-S-)，3. 55 (t，CH2-CH2-0H)，2. 94 (br，CH2-CH2-N-，NH2-CH2-(CH2) 3-CH-)，2. 81 (dd，-CH2-S-CH2)，2. 57 (br，-N-CH2-CH2-C( = 0) -0)，1. 85 (m，NH2- (CH2)3-CH 2-CH-)，1· 74 (br，-0-CH2-CH2-CH2-CH2-0)，1· 68 (m，NH2-CH2-CH2- (CH2) 2-CH_)，1· 54 (br，-CH2-CH2-CH2-CH2-0H)，1. 37 (br，-N- (CH2) 2-CH2- (CH2) 2-0H)。
[0211] (c)三組氨酸修飾的寡肽（H3C-C32-CH3)根據(jù)相同方案制備并且表征如下：
[0212] IR(蒸發(fā)膜）：v= 720, 799, 832, 1040, 1132, 1201，1335, 1403, 1467, 1539, 1674(C =〇，自肽酰胺），1731(C= 0，自酯），2865,2941,3336(^11,0-11)0111
[0213]^-NMR(400MHz,CD30D,TMS) (ppm) :δ= 8. 0-7. 0(br-N( =CH)-NH-C( =CH)-)4. 61-4. 36 (br, -CH2-CH-)，4. 16 (t,CH2-CH2-0-)，3. 55 (t,CH2-CH2-0H)，3. 18 (t,CH2-CH2-N-，3. 06 (dd, -CH2-CH-), 2. 88 (br,OH- (CH2) 4-CH2-N-), 2. 82 (dd, -CH2-S-CH2-), 2. 72 (br, -N-CH2-CH 2-C( = 0) -0)，1. 75 (br，-0-CH2-CH2-CH2-CH2-0)，1. 65 (m，NH2-CH2-CH2- (CH2) 2-CH_)，1. 58 (br， -CH2-CH2-CH2_CH2-0H)，1. 40 (br, -N- (CH2) 2-CH2- (CH2) 2-0H) 〇
[0214]實(shí)施例6:具有不對(duì)稱(chēng)末端修飾的PBAE的合成
[0215] 通常，如下獲得不對(duì)稱(chēng)寡肽修飾的PBAE:將丙烯酸酯-封端的聚合物C32(或 C32SS)和胺-或硫醇-封端的寡肽（例如，CR3,R3或CE3)以1:1的摩爾比在DMS0中混 合。將混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。加入等摩爾量的第二胺-或硫醇-封端的寡肽，或伯胺，并 將混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。通過(guò)在二乙醚/丙酮（3:1)中沉淀獲得產(chǎn)生的不對(duì)稱(chēng)PBAE聚 合物。
[0216] 以下用于獲得不對(duì)稱(chēng)末端修飾的B3-C32-CR3PBAE的合成步驟作為實(shí)例顯示： 將中間體C32 (0. 15g，0. 075mmol)在DMSO(2mL)中的溶液與寡肽Cys-Arg-Arg-Arg(CR3 ; 0. 055g，0. 075mmol)在DMSO(lml)中的相應(yīng)溶液混合并在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。接著，在DMS0中， 在室溫，將2-甲基-1,5-戊二胺（0. 017g，0. 02ml，0. 15mmol)加入混合物中達(dá)4h。通過(guò)在 二乙醚/丙酮（3:1)中沉淀過(guò)夜獲得不對(duì)稱(chēng)末端修飾的聚合物B3-C32-CR3與B3-C32-B3 和R3C-C32-CR3的混合物?；旌衔餆o(wú)進(jìn)一步純化即可使用或所述不對(duì)稱(chēng)末端修飾的聚合物 B3-C32-CR3可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法從混合物分離。
[0217]
[0220] 實(shí)施例8 :聚合物-DNA復(fù)合物的形成和表征
[0221] 所有聚合物的儲(chǔ)液制備在DMS0中（100mg/ml)。將這些聚合物溶液以適當(dāng)?shù)臐舛?稀釋?zhuān)?5mM乙酸鹽緩沖液pH5. 0)，獲得所需比例聚合物-DNA(w/w)。然后將100μ1稀釋 的聚合物加至100μ1質(zhì)粒DNA(60μg/mL在乙酸鹽緩沖液25mMpH5. 0中），渦旋劇烈混 合數(shù)秒，然后在37°C溫箱中孵育30min。將得到的納米顆粒稀釋在磷酸鹽緩沖鹽水中用于 納米顆粒表征。使用動(dòng)態(tài)光散射（Zetasizernanozs90，MalvernInstruments)就尺寸和 ζ電勢(shì)表征聚合物-DNA復(fù)合物。結(jié)果顯示在圖1中。
[0222] 納米顆粒還通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳表征。為了評(píng)估質(zhì)粒延遲，將不同w/w比例的含 有0. 48μgpGFP的PBAE-DNA復(fù)合物加至瓊脂糖凝膠（0. 8%，含有1μg/mL溴化乙錠）的 孔中。將樣品在60V運(yùn)行45min(ApelexPS305，F(xiàn)rance)以分辨質(zhì)粒延遲并且通過(guò)UV照 射可視化。結(jié)果顯示在圖2中。
[0223] 實(shí)施例9 :質(zhì)子海綿效應(yīng)
[0224] 質(zhì)子海綿效應(yīng)是顯示促進(jìn)內(nèi)體逃逸的現(xiàn)象并且由具有高緩沖能力的聚合物介導(dǎo)， 導(dǎo)致增加的轉(zhuǎn)染效率（Varkouhi，A.K.等人，J.Control.Rel. 151220 - 228(2011)·)。通 常，在其結(jié)構(gòu)中具有叔胺的聚合物在5. 0至7. 5的內(nèi)體pH范圍顯示緩沖效應(yīng)，其引起滲透 壓增加，導(dǎo)致內(nèi)體破壞Behr，J.Chimia234 - 36(1997))。根據(jù)質(zhì)子海綿效應(yīng)，新合成的聚 (β-氨基酯）的緩沖能力通過(guò)聚合物溶液的酸滴定確定（圖2)。
[0225] 通過(guò)酸堿滴定確定聚合物的緩沖能力。簡(jiǎn)言之，將聚合物以lmg/mL的最終濃度 溶解在氯化鈉水溶液（150mM)中。將得到的聚合物溶液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH10。通過(guò)逐 步加入10μL