一種關(guān)于hpv病毒的新型佐劑疫苗組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及以磷酸鈣-聚合物復(fù)合顆粒為佐劑的疫苗組合物，及該疫苗組合物的 制備方法及其在藥中的用途。本發(fā)明尤其針對由HPV蛋白制成的疫苗組合物及其在治療或 預(yù)防HPV病毒藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭瘤病毒（Humanpapillomaviruses，HPV)是無囊膜的雙鏈DNA病毒，主要由 病毒外殼和基因組DNA組成（King，Adamsetal.2012)。HPV病毒外殼是由360個(gè)L1蛋白 (形成72個(gè)五聚體）和至多72個(gè)L2蛋白構(gòu)成的二十面體結(jié)構(gòu)，直徑55_60nm(Howleyand Lowy2007)。病毒外殼蛋白具有自組裝特性，在體外L1蛋白單獨(dú)或與L2蛋白共同自組裝 形成類病毒樣顆粒（Virus-likeParticle，VLP)(Chen，Garceaetal.2000，Clementsand Griffiths2002,Chen，Nietal. 2011，WangandRoden2013)。目前的HPV疫苗都是以 VLP作為靶抗原，已有兩種基于HPVLIVLP預(yù)防性疫苗上市，均以鋁鹽為佐劑（Jansenand Shaw2004,HowleyandLowy2007,Buonaguro,Torneselloetal. 2009,Harper2009, Frazer,Leggattetal. 2011,Hariri,Dunneetal. 2011,Malagon,Droletetal. 2012, LehtinenandDillner2013，Shaw2013)。2006 年 6 月 8 日，美國食品與藥品管理局 (FDA)正式批準(zhǔn)美國Merck公司生產(chǎn)的GardasilHPV預(yù)防性疫苗上市；它是由釀酒酵母表 達(dá)并純化的HPV16/18/6/11LIVLP四價(jià)宮頸癌預(yù)防性疫苗，以無定形羥基磷酸鋁硫酸鹽 (amorphousaluminumHydroxyphosphatesulfate，AAHS)為佐劑，被批準(zhǔn)用于預(yù)防 6 ~26 歲女孩和婦女HPV16、18、6、11型感染所引起的宮頸癌、癌前病變和生殖器疣，這是FDA通 過的世界上第一個(gè)腫瘤疫苗（Villa，Costaetal· 2005，Villa，Aultetal· 2006，Bryan 2007,Olsson,Villaetal. 2007,GoldstoneandVuocolo2012) 〇 隨后英國葛蘭素史 克（GSK)公司生產(chǎn)的商品名為Cervarix的HPV預(yù)防性疫苗也成功上市，它是由來源于昆 蟲表達(dá)系統(tǒng)的HPV16/18LIVLP二價(jià)宮頸癌預(yù)防性疫苗，采用AS04佐劑（氫氧化鋁復(fù)合 MPL)(Paavonen,Jenkinsetal. 2007,Garcon,Moreletal. 2011,Kreimer,Gonzalezet al· 2011,Szarewski2012) 〇
[0003] 佐劑是指能非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對抗原的特異性免疫應(yīng)答，而本身并無抗 原性的物質(zhì)，又稱免疫佐劑或抗原佐劑。傳統(tǒng)疫苗直接來源于細(xì)菌和病毒，具有較高的免 疫原性，但存在較大的安全性問題。隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展，利用基因重組、生物合成及 化學(xué)合成獲得的亞單位疫苗、合成肽疫苗等，結(jié)構(gòu)簡單，易于純化，安全穩(wěn)定，但是抗原的免 疫原性減弱，難以誘導(dǎo)良好的免疫保護(hù)性應(yīng)答，必須添加免疫佐劑來增強(qiáng)免疫效果（Singh andSrivastava2003,Zepp2010)〇
[0004] 目前，磷酸鈣、MF59、鋁佐劑在歐洲許多國家已經(jīng)被批準(zhǔn)用于人類疫苗（Singh, Carlsonetal· 1998,He，Mitchelletal· 2000)。鋁佐劑是目前應(yīng)用最為廣泛的一類佐 劑，也是長期以來一度是被美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA)批準(zhǔn)用于人類疫苗的唯一 佐劑（Glenny，Popeetal· 1926，GuptaandSiber1995，Gupta1998，Baylor，Eganet al. 2002,ClementsandGriffiths2002,Lindblad2004,Lindblad2004)。盡管鋁佐劑 可以有效增強(qiáng)免疫應(yīng)答，但也存在一些不足。鋁佐劑僅在注射部位形成貯庫效應(yīng)（Gupta， Changetal. 1996,Hem2002,Verdier,Burnettetal. 2005,HemandHogenEsch2007, 1^〇6，6代6116七31.2010)，通過炎癥反應(yīng)吸引樹突狀細(xì)胞（0(])(]\1〇代1161(1，3〇1?)1〇￥81^6七 al. 2005,Kool,Soullieetal. 2008,Sharp,Ruaneetal. 2009,Flach,Ngetal. 2011, Ghimire，Bensonetal· 2012)、巨嗤細(xì)胞（Μφ) (Hamilton,Byrneetal· 2000，Jordan, Millsetal· 2004，Rimaniol，Grasetal· 2004，Rimaniol，Grasetal· 2007)等抗原呈 遞細(xì)胞（antigen-presentingcell,APC)，這些細(xì)胞通過吞嗤作用攝取抗原并經(jīng)NLRP3炎 性小體激活免疫應(yīng)答（DeGregorio，Trittoetal.2008，Dostert，Petrillietal· 2008， Eisenbarth,Colegioetal· 2008,FranchiandNunez2008,Kool,Petrillietal.2008, Li,Willinghametal. 2008,Cassel,Jolyetal. 2009,Demento,Eisenbarthetal. 2009, Duewell，Konoetal.2010，Davis，Wenetal· 2011)。同時(shí)，錯(cuò)佐劑通過刺激IL-10 分泌等 機(jī)制對細(xì)胞免疫產(chǎn)生抑制作用（Chen，Nietal. 2011)，而對于病毒感染而言，細(xì)胞免疫效 果將發(fā)揮更好地免疫保護(hù)和免疫防治作用（(VHaganandValiante2003，Demento，Cuiet al. 2012,LevitzandGolenbock2012,Olive2012,Cain,Sandersetal. 2013,HogenEsch 2013)。而且，鋁佐劑可引起IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)（如注射部位肉芽腫）以及神經(jīng)系統(tǒng)不 良反應(yīng)等，從而引起人們對錯(cuò)佐劑安全性的擔(dān)憂（Petrik，Wongetal.2007,Bystrianyk 2009,ShawandPetrik2009,Munks,McKeeetal. 2010,TomljenovicandShaw2011) 〇 另外，錯(cuò)佐劑對流感（AtmarandKeitel2009)、痕疾（Lew,Andersetal_1988，Schwartz， Brownetal· 2012)、單皰瘆病毒（Geerligs，Weijeretal· 1989)誘導(dǎo)的佐劑免疫效應(yīng)比 較微弱。為此，需要針對HPV抗原的候選疫苗開發(fā)新型免疫佐劑（CampoandRoden2010， MarianiandVenuti2010,Chen,Nietal. 2011,Foged2011,Gattoc,Nairetal.2013, Koff，Burtonetal.2013，Shaw2013，Tomlenovic，Spinosaetal.2013)。新型免疫佐劑的 設(shè)計(jì)思路應(yīng)具有較低的副作用，增強(qiáng)免疫耐受，同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答和粘 膜免疫應(yīng)答。而且具備生物可降解性，相容性，安全性的優(yōu)點(diǎn)，且易于制備。另外，理想的佐 劑可以有選擇性的激發(fā)免疫應(yīng)答，例如由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答和由CD8+T 介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，并具有對抗原的廣譜性和等效適用性（He，Mitchelletal. 2000)。
[0005] 磷酸鈣作為天然骨骼的主要礦物成分，具有優(yōu)越的的生物相容性、生物可降解性、 生物活性（deGroot1983，Aoki1991，Goto，Katoetal.l993，LeGeros2008)。在歐洲一 些國家，磷酸1丐已經(jīng)作為佐劑，已經(jīng)被批準(zhǔn)用于疫苗佐劑（Aggerbeck，F(xiàn)engeretal. 1995， Gupta1998，Jiang,Premachandraetal· 2004)，例如用于預(yù)防白喉、破傷風(fēng)疾病，以及過 敏原的脫敏治療。磷酸鈣佐劑可以誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞免疫效 應(yīng)，從而彌補(bǔ)鋁鹽佐劑只能誘導(dǎo)微弱的或抑制細(xì)胞免疫方面的不足。