而且Goto等人研究結(jié) 果表明注射磷酸鈣凝膠和懸液，局部肌肉組織炎癥反應(yīng)到第四周完全停止，而注射氫氧化 鋁凝膠和懸液引起的局部肌肉刺激一直持續(xù)至第八周（Goto,Katoetal. 1997)。與鋁佐 劑相比，磷酸媽佐劑在注射部位不會引起明顯的IgE超敏反應(yīng)（Relyveld1985，Guptaand Siber1994,He,Mitchelletal· 2000)，而且磷酸|丐誘導(dǎo)了相比錯佐劑更高效的IgG2a抗 體反應(yīng)和更弱的IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，可以有效抵抗單純皰疹病毒2 (HSV-2)病毒的感染 (He，Mitchelletal· 2000,He，Mitchelletal· 2000,He，Mitchelletal· 2002)。磷酸 鈣佐劑復(fù)配CpG用于流感疫苗，有效誘導(dǎo)了小鼠脾CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中IFN-γ的分 泌（Rimaniol，Grasetal.2007)。
[0006] 佐劑的粒徑對其免疫效應(yīng)具有很重要的影響。近年來大量文獻(xiàn)證實(shí)，體內(nèi)可生 物降解的聚合物納微球通過包埋抗原，可將其轉(zhuǎn)化為顆粒型抗原，有利于被抗原提呈細(xì)胞 攝取，進(jìn)而在胞內(nèi)釋放抗原，通過后續(xù)抗原加工、提呈，增強(qiáng)免疫應(yīng)答強(qiáng)度和水平（Langer， Clelandetal.1997,Johansen,Menetal.2000,Sahay,Alakhovaetal.2010,De Temmerman,Rejmanetal. 2011,Danhier,Ansorenaetal· 2012) 〇 例如，TorresΜ.P.等 人制備了聚苷類微球，以卵清蛋白（OVA)為模型抗原，研究微球的佐劑效果，結(jié)果表明微球 能夠提高抗原提呈細(xì)胞表面MHC分子表達(dá)和相關(guān)細(xì)胞因子分泌，顯示其具有一定的佐劑效 應(yīng)（Torres，Wilson_Welderetal.2011);又如UtoT.等人制備了生物可降解的聚谷氨酸 納微球（Y-PGANPs)并從機(jī)制上研究了其佐劑性能，揭示此微球能通過TLR4 (Toll樣受體） 和MyD88信號通路誘發(fā)強(qiáng)有力的固有和獲得性免疫應(yīng)答反應(yīng)（Uto,Akagietal· 2011)。 研究表明，上述攜載抗原的微粒型佐劑使可溶性抗原變成顆粒型抗原，而顆粒型抗原被APC 攝取后，可以改變抗原的提呈途徑，不僅可以激活CD4+T細(xì)胞，而且可以激活CD8+T細(xì)胞，大 大提升細(xì)胞免疫功能，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)感染的徹底清除，是有前景的病毒感染疫苗佐劑與遞送系 統(tǒng)（WangandSingh2011，Dierendonck，DeKokeretal.2012)。此外，生物可降解聚合物 微球可以提供大量抗原并保護(hù)其免受在生理?xiàng)l件下的快速降解，通過微球?qū)λ窨乖?持續(xù)或脈沖釋放行為，有效模擬傳統(tǒng)疫苗多次免疫程序，減少接種次數(shù)和免疫原的使用總 量，因而改進(jìn)了病人的適應(yīng)性、降低了用藥成本（Langer，Clelandetal· 1997,Johansen, Estevezetal. 2000,DeTemmerman,Rejmanetal. 2011,Demento,Cuietal· 2012)〇
[0007] 近些年來，研究者一直專注于開發(fā)一種新型的由生物可降解的高分子聚合物結(jié)合 磷酸鈣的復(fù)合納微球作為藥物遞送載體，保持了磷酸鈣材料的所具有的的生物活性、生物 相容性；擴(kuò)大了磷酸鈣材料的生物可降解性；解決了聚乳酸材料在降解過程中出現(xiàn)的酸性 炎癥反應(yīng)，集中兩者的優(yōu)勢，克服兩者的局限性，從而有希望成為一個優(yōu)良的藥物遞送載 體，為醫(yī)療事業(yè)服務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明第一方面提供一種粒徑分布在100nm~100μm之間的磷酸鈣與聚合物的 復(fù)合顆粒，其中磷酸鈣是一個包含鈣離子和磷酸根離子的生物材料，可具有不同的Ca與P 摩爾比，例如Ca:P為0. 1-5 : 1。聚合物為帶負(fù)電，且zeta電位最小至-30mV的直鏈或 有支鏈的聚合物、均聚物、生物聚合物、共聚物，或以上的混合物。例如：聚合物材料包括但 不限于聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA)，PMMA，PEG，聚乳酸（PLA)，PLLA，PCL，或以上的混 合物。復(fù)合顆粒的zeta電位范圍是-5mV到+30mV。
[0009] 其中磷酸鈣與聚合物的質(zhì)量比為1 : 0. 1-100,優(yōu)選1 : 1-10。
[0010] 本發(fā)明第二方面提供一種疫苗組合物，包含佐劑和抗原，抗原與佐劑的比例為 0. 01-80μg/mg，優(yōu)選1-40μg/mg，所述佐劑包括磷酸媽與聚合物的復(fù)合顆粒，所述抗原包 含HPV蛋白。進(jìn)一步的，HPV蛋白吸附于復(fù)合顆粒表面，以粒徑分布在100nm~100μπι之 間的納微球懸浮液形式存在。
[0011] 本發(fā)明所述佐劑中進(jìn)一步包含小分子免疫佐劑：CpG、MPLA、咪喹莫特、PolyI:C等 中一種或幾種的組合。
[0012] 本發(fā)明所述抗原HPV蛋白包括HPVL1蛋白、HPVL2蛋白、或HPVL1+L2蛋白。上 述的HPV蛋白包括但不限于 1 ~4,6, 7,10,11，16,18, 26 ~29, 31，33, 35, 39,49, 51，52, 56， 58,59 和 68 型之一的HPV，優(yōu)選HPV6、11、16、18、31、33、35、45、52 或 58 型的HPVLI、HPV L2、或HPVL1+L2的VLP、五聚體或多聚體。
[0013] 本發(fā)明第三方面提供一種磷酸鈣與聚合物的復(fù)合顆粒的制備方法，制備方法為A 方法或B方法：
[0014]A方法：用含鈣離子的水溶液為內(nèi)水相（Wl)，PLGA溶于有機(jī)溶劑為油相（0)，將所 述內(nèi)水相與油相按1 : 1-50,優(yōu)選1 : 2-10體積比混合，制成油包水型（W1/0)初乳，將此 初乳按1 : 1-50,優(yōu)選1 : 2-10體積比加入含表面活性劑的外水相（W2)中，攪拌，制得W1/ 0/W2型預(yù)復(fù)乳液，將所述W1/0/W2型預(yù)復(fù)乳液反復(fù)壓過濾膜得到尺寸均一的W1/0/W2型乳 液，將W1/0/W2型乳液固化，過程中按Ca:P摩爾為0. 1-5 : 1的比例加入包含磷酸根離 子的溶液混合，洗滌、干燥后制成PLGA-CaP復(fù)合顆粒；
[0015]B方法：將PLGA溶于有機(jī)溶劑為油相（0)，含表面活性劑的溶液為外水相（W)，兩 相按1 : 1-50,優(yōu)選1 : 2-10體積比混合，制成水包油型（0/W)預(yù)乳液，將所述W/0型預(yù) 乳液反復(fù)壓過膜得到尺寸均一的0/W型乳液，將0/W型乳液固化，洗滌、干燥后制成PLGA顆 粒，然后先用包含鈣離子的水溶液與PLGA顆?；旌?，再按Ca:P摩爾為0.1-5 : 1的比例 與包含磷酸根離子的水溶液混合，洗滌、干燥后得到PLGA-CaP復(fù)合顆粒。
[0016] 上述復(fù)合顆粒的制備方法中包含鈣離子和磷酸根離子的礦物質(zhì)家族，鈣離子為羥 基磷灰石、無定型磷酸鈣、磷酸三鈣、磷酸八鈣、磷酸氫鈣、四水合硝酸鈣或氯化鈣等可溶性 鈣鹽，或者為它們的混合物。磷酸根離子為磷酸氫二銨，磷酸氫二鉀，磷酸氫二鈉和正磷酸 中之一或其混合物。
[0017] 所述油相為常溫下呈液體且與水不互溶的油性物質(zhì)，優(yōu)選為乙酸乙酯、丙酮、二氯 甲烷、三氯甲烷或上述至少兩種以上的混合物。
[0018] 在本發(fā)明具體實(shí)施例中上述方法所述的含有表面活性劑的外水相（W2或W)為含 有0. 001-10 %的PVA水溶液，其醇解度為87~90 %，聚合鏈節(jié)數(shù)為1700-1750 ;或?yàn)楹?0. 001-10%的PVA-PEG混合水溶液，PVA與PEG的質(zhì)量百分比為20-80 : 30-90。
[0019] 在本發(fā)明的具體的實(shí)施例中，混合方法包括但不限于通過均質(zhì)、超聲或攪拌等方 式。
[0020] 在本發(fā)明的具體的實(shí)施例中，乳液反復(fù)壓過濾膜是指乳液在0. 5KPa作用下反復(fù) 壓過5. 3微米的微孔膜。
[0021] 在本發(fā)明的具體的實(shí)施例中固化方式為溶劑蒸發(fā)法或溶劑萃取法。
[0022] 在本發(fā)明的具體的實(shí)施例中，固化時間為lh_12h。
[0023] 本發(fā)明第四方面提供一種疫苗組合物的制備方法，將復(fù)合顆粒作為佐劑懸浮于緩 沖液體系，HPV蛋白作為抗原溶于緩沖液體系，然后將兩緩沖液體系混合，配制成含有HPV 抗原的微球懸液，制得HPV疫苗組合物。
[0024] 疫苗組合物制備方法中緩沖液體系為磷酸、硼酸、Tris、HEPES或MOPS緩沖液，pH 值范圍4-10。
[0025] 在本發(fā)明的具體的實(shí)施例中的疫苗組合物，還包括可藥用載體，例如賦形劑、稀釋 劑、穩(wěn)定劑、緩沖液或替代性物質(zhì)。
[0026] 本